长非编码RNA GAS5对人胶质瘤细胞生物学行为的影响及机制研究

发布时间：2018-02-11 06:54

本文关键词： 人胶质瘤细胞长链非编码RNA GAS5 微小RNA　出处：《重庆医科大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景:神经胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤。其中,恶性胶质瘤超过了50%,绝大部分胶质瘤生长迅速并具有高度的侵袭性。外科手术和放化疗等传统治疗方法有其自身的局限。过去的几十年,人们在基因和免疫治疗上有所进展,但也没能显著提高病人的总体生存率。因此,迫切需要找到胶质瘤形成和发展中的关键分子,以便为胶质瘤的治疗提供新的靶点。资料显示,人类有超过90%以上的转录后的RNA为非编码RNA,其长度大于200nt的非编码RNA被定义为长非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)。近年来的研究发现,lnc RNA具有的多种细胞生物学功能,这些功能将对细胞生物学行为产生重大影响。众多资料显示,lnc RNA可以作为癌基因或抑癌基因在肿瘤细胞的增殖,迁移和侵袭过程中发挥作用。lnc RNA主要通过在转录水平或转录后水平对影响肿瘤细胞生物学行为的基因表达进行调控,从而改变肿瘤细胞的生物学行为。近年来的研究发现,lnc RNA可以通过调控micro RNA,从而影响下游信号通路。本课题组于前期研究中,筛选出在神经胶质瘤中可能发挥重要作用的长非编码RNA GAS5。本课题就GAS5对人胶质瘤细胞生长,迁移和侵袭能力的影响及机制进行探讨。目的:探讨GAS5对人胶质瘤细胞U251和U87细胞增殖、周期、侵袭和迁移的影响及其机制。方法:1.过表达或敲低GAS5后,采用MTS实验、流式细胞仪、划痕实验、transwell小室迁移和侵袭实验以及裸鼠皮下成瘤实验研究GAS5在人胶质瘤细胞中的功能。2.采用生物信息学技术预测可能与GAS5相互作用的micro RNA。3.采用实时定量PCR(QRT-PCR)验证生物信息学预测的micro RNA,确认出真正能被GAS5下调的靶micro RNA。4.为了证实靶micro RNA也能下调GAS5的表达,通过转染mi R-18a-5p mimics和inhibitor使靶micro RNA在U251细胞中过表达或敲低后,检测GAS5的表达变化。5.应用原位杂交(In situ Hybridization,ISH)在组织芯片(包括胶质瘤和正常脑组织)中检测GAS5和靶micro RNA表达的关系。6.生物信息学技术预测靶micro RNA与GAS5相互作用的结合位点并进一步验证。7.过表达GAS5后,QRTPCR检测靶micro RNA前体(Pre-mi RNA)和原始靶micro RNA(pri-mi RNA)的表达。8.RNA沉淀方法检测GAS5与靶micro RNA的相互作用是否需要RISC的参与。9.探讨GAS5作用于人胶质瘤细胞的信号通路。在胶质瘤细胞中过表达GAS5后,Western blot检测靶micro RNA的下游靶基因的表达变化。结果:1.过表达GAS5后,U251和U87细胞的增殖能力,迁移和侵袭能力明显减弱。敲低GAS5的表达后,U251和U87细胞的增殖能力,迁移和侵袭能力增加。与对照组相比,GAS5明显抑制裸鼠体内的肿瘤生长。2.生物信息学技术预测可能与GAS5相互作用的micro RNA共有46个。3.QRTPCR验证46 micro RNA后发现,过表达GAS5能降低mi R-18a-5p的表达水平,同时,敲低GAS5能增加mi R-18a-5p的表达;4.过表达mi R-18a-5p能降低GAS5的表达,敲低mi R-18a-5p后增加了GAS5的表达。5.原位杂交结果显示,在正常脑组织中,GAS5的表达上调,mi R-18a-5p的表达下调,而在胶质瘤组织中,GAS5的表达下调,mi R-18a-5p的表达上调。6.生物信息学技术预测出GAS5和mi R-18a-5p之间的一个结合位点。将结合位点删除后的GAS5(d-GAS5)不能降低mi R-18a-5p的表达,MTS结果显示,相对于GAS5对U251细胞增殖的抑制程度而言,d-GAS5对U251细胞增殖的抑制减弱。7.过表达GAS5后,pri-mir-18a-5p和pre-mir-18a-5p的表达无变化,提示GAS5对mi R-18a-5p是转录后调控。8.RNA沉淀方法证实GAS5与mi R-18a-5p之间相互作用需要RISC的参与。9.过表达GAS5后,mi R-18a-5p的靶基因Neogenin的表达增加。结论:1、GAS5可显著抑制人胶质瘤细胞体外增殖、迁移和侵袭能力;2、GAS5与mi R-18a-5p通过互补结合位点直接结合,相互降低对方的表达水平,此过程需要RISC的参与;3.GAS5在胶质瘤中通过降低mi R-18a-5p的表达,进而影响到mi R-18a-5p的下游靶基因Neogenin的表达,从而发挥抑癌基因的功能。
[Abstract]:Background : Gliomas are the most common primary intracranial tumors . Among them , malignant glioma is more than 50 % . Most of the gliomas grow rapidly and have a high degree of invasion . In the past few decades , there has been an urgent need to find key elements in the formation and development of glioma , so as to provide a new target for the treatment of glioma . In recent years , it has been found that the expression of GAS5 and target micro RNA in human glioma cells can be regulated by means of real - time quantitative PCR ( QRT - PCR ) . 5 . The results showed that the expression of miR - 18a - 5p decreased and the expression of miR - 18a - 5p decreased .

【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41

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