YAP基因在胰腺癌迁移、侵袭及血管生成中的作用和机制研究

发布时间：2018-02-13 13:03

本文关键词： 胰腺癌 YAP 预后胰腺癌 YAP 侵袭血管生成缺氧诱导因子1α Hippo通路 EMT 侵袭胰腺癌维替泊芬凋亡血管生成　出处：《山东大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：胰腺癌,其主要的病理类型为胰腺导管腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC),是恶性程度极高的消化道肿瘤,号称"癌中之王";五年生存率不足5%。由于肥胖、高脂饮食、糖尿病、吸烟、酒精依赖及慢性胰腺炎等原因,胰腺癌的发病率呈逐年上升趋势。胰腺癌起病隐匿,仅有15%-20%的病人获得根治性手术机会,并且胰腺癌容易发生早期转移、对传统放化疗不敏感及治疗方法的局限,造成其高死亡率。因此,深入研究胰腺癌的早期转移机制,探索新的治疗方法显得极其重要。近年研究表明Hippo通路通过调控细胞增殖与凋亡参与器官发育、干细胞全能性维持等过程。最新研究表明Hippo通路在肿瘤发生、进展及转移过程中也发挥了重要作用。YAP(Yes associated protein1,YAP)基因是Hippo通路中的最核心转录共激活因子。Hippo通路参与到一系列激酶的激活过程导致YAP在细胞浆中磷酸化降解;非磷酸化的YAP可以进入到细胞核参与一系列的转录因子激活过程,如TEADs、SMAD、RUNX和CTGF等。YAP基因还参与肿瘤干细胞维持、上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)、迁移及侵袭和化疗耐药等多种肿瘤生物学行为。高表达的YAP在胰腺癌的发生、发展及复发过程中发挥了重要作用。但目前对YAP如何调控肿瘤微环境、促进肿瘤侵袭及血管生成的相关机制还不明确。缺氧微环境广泛存在于实体肿瘤中,并且和肿瘤侵袭、细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)降解及上皮间质转化等密切相关。缺氧诱导因子1a(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)是缺氧通路最重要的转录因子,在胰腺癌的进展及转移过程中发挥了重要作用。胰腺癌中HIF-1α高表达,并且和肿瘤侵袭、细胞外基质降解及上皮间质转化等行为相关。YAP的活化也和细胞外基质中的氧浓度密切相关。因此研究缺氧条件下Hippo通路如何调控胰腺癌的侵袭具有重要意义。维替泊芬(Veterporfin,VP)是临床中应用的光敏剂,主要用于治疗年龄相关的黄斑变性。研究发现维替泊芬可以通过干扰YAP-TEAD复合体的形成,抑制Hippo通路相关蛋白表达。维替泊芬还可以通过抑制YAP表达,抑制肿瘤发生、侵袭及血管生成;但维替泊芬在胰腺癌中抗肿瘤的作用及机制尚不明确。因此深入研究维替泊芬的抗肿瘤机制,将为胰腺癌的治疗提供新的思路。本实验将研究YAP在胰腺癌中的表达分布,分析YAP表达与临床病理指标间的关系,并深入探究YAP基因调控胰腺癌迁移、侵袭及血管生成的作用和机制;我们还将进一步研究缺氧条件下Hippo通路失活的分子机制;同时我们也将研究Hippo通路抑制剂维替泊芬在胰腺癌中抗肿瘤的作用及机制;这将为胰腺癌靶向YAP的治疗提供实验及理论依据。第一部分YAP在胰腺癌组织中的表达及其意义研究目的:本部分主要研究YAP在胰腺癌组织及癌旁组织中mRNA及蛋白表达水平;分析胰腺癌组织中YAP表达和临床病理指标间的相关性,并分析YAP与胰腺癌病人术后预后之间的关系。研究方法:本实验获得山东大学附属山东省千佛山医院伦理委员会批准,共在山东省千佛山医院获取19例胰腺癌手术标本,所有胰腺癌病人已签署知情同意书。同时利用胰腺癌组织芯片,分析YAP与胰腺癌病人术后预后之间的相关性。1.YAP的mRNA及蛋白在胰腺癌及癌旁组织中的表达检测:获取胰腺癌新鲜冰冻标本,利用qRT-PCR,Western Blot及免疫荧光技术检测YAP的mRNA及蛋白表达水平。2.胰腺癌中YAP表达水平和病人临床病理指标之间的相关性分析:利用胰腺癌组织芯片,采用免疫组化检测YAP表达水平,采用χ2检验分析胰腺癌组织及癌旁组织中YAP差异表达,并分析胰腺癌组织中YAP与病人临床病理资料之间的相关性。3.胰腺癌组织中YAP表达和病人术后预后之间的相关性:采用Kaplan-Meier分析绘制生存曲线,分析YAP表达水平和胰腺癌病人术后生存期的关系。结果:1.胰腺癌中YAP的mRNA及蛋白在肿瘤组织中高表达。2.在胰腺癌组织芯片中,我们发现63例肿瘤组织中有37例YAP在细胞核中高表达,和癌旁组织中YAP表达有明显差异(P0.01);并且胞核YAP的表达和胰腺癌的病理分化程度相关,和性别、年龄、肿瘤大小、位置、TNM分期及临床分期无明显相关性。3.肿瘤组织中胞核YAP的高表达和不良预后呈正相关。结论:1.胰腺癌肿瘤组织中YAP高表达;并且胞核YAP的表达和病理分化程度相关。2.胰腺癌中胞核YAP表达可以作为预示胰腺癌术后不良预后的指标。并且将来有可能作为胰腺癌治疗的一个新型潜在靶点。第二部分YAP基因在胰腺癌侵袭、迁移及血管生成中的作用及机制研究研究目的:体外实验研究YAP在胰腺癌迁移、侵袭及血管生成的作用和机制。研究方法:1.选取常见五种胰腺癌细胞系(PANC-1、BxPC-3、SW1990、MiaPaCa-2、Panc 02.03)及正常胰腺导管上皮细胞(HPDE6),提取mRNA及总蛋白,用qRT-PCR及Western Blot的方法检测YAP的表达水平;筛选出高表达YAP的细胞系用于后续实验。2.胰腺癌细胞系PANC-1及BxPC-3分别转染沉默质粒shYAP,筛选出稳定细胞株;qRT-PCR及Western Blot检测YAP表达水平;利用划痕实验及Transwell实验检测沉默YAP对胰腺癌细胞迁移及侵袭能力的影响。3.利用 Western Blot 检测沉默 YAP 对 EMT 相关蛋白 E-cadherin、Vimentin、Snail 及 MMP2、MMP13 的影响。4.选取人脐静脉内皮细胞(HUVECs),分别沉默或过表达YAP;利用Transwell实验和小管形成实验,检测YAP对血管生成能力的影响;Western Blot检测血管生成素2(Ang2)表达。结果:1.胰腺癌细胞系中YAP的mRNA及蛋白表达水平明显高于HPDE6。2.沉默表达载体shYAP可以有效抑制胰腺癌细胞中YAP的表达;沉默YAP可以抑制胰腺癌的迁移及侵袭能力。3.沉默 YAP 后 E-cadherin 表达水平升高,Vimentin、Snail、MMP2 及 MMP13表达水平降低。4.沉默YAP减弱HUVECs小管形成能力,过表达YAP增加了 HUVECs小管形成能力;且沉默YAP导致Ang2水平降低,过表达YAP诱导Ang2表达水平升高。结论:1.胰腺癌细胞系中YAP表达水平明显升高。2.YAP可以通过EMT及MMPs途径重塑肿瘤微环境,促进胰腺癌的迁移及侵袭。3.YAP通过调控Ang2的表达,影响胰腺癌的血管生成能力。第三部分缺氧诱导YAP核转运导致Hippo通路失活促进胰腺癌的侵袭研究目的:本部分主要探讨HIF-1α及YAP在胰腺癌组织中表达的相关性;并深入研究缺氧微环境影响胰腺癌侵袭能力及Hippo通路的分子机制。研究方法:1.检测19例胰腺癌组织标本中HIF-1α的mRNA表达水平;采用Peαrson检验分析HIF-1α及YAP的mRNA表达水平间的相关性。2.通过划痕实验及Transwell实验检测缺氧对胰腺癌细胞迁移及侵袭能力的影响;qRT-PCR和Western Blot检测EMT相关蛋白、MMP2及MMP13的表达水平。3.Western Blot检测缺氧对Hippo通路相关蛋白影响;分别提取细胞核及细胞质中蛋白,检测缺氧对YAP表达水平及部位影响;进一步通过激光共聚焦显微镜检测HIF-1α和YAP蛋白的表达和定位。4.缺氧环境下,分别沉默HIF-1α及YAP,通过Transwell检测对胰腺癌细胞侵袭能力影响;qRT-PCR和Western Blot检测EMT相关蛋白、MMP2及MMP13的表达水平;Western Blot检测Hippo通路相关蛋白变化。结果:1.胰腺癌组织中HIF-1α的mRNA高表达,并且和YAP的表达有相关性。2.缺氧增强了 PANC-1及BxPC-3的迁移及侵袭能力;缺氧条件下E-cadherin 表达减少,Snail、Vimentin、MMP2 及 MMP13 表达增加。3.缺氧条件下,HIF-1α表达增加,pYAP表达减少,TEAD表达增加;缺氧增加了胞核YAP/胞质YAP的比例。4.缺氧条件下,沉默HIF-1α或YAP抑制胰腺癌的侵袭;沉默HIF-1α或YAP 诱导 E-cadherin 表达增加,Snail、Vimentin、MMP2 及 MMP13 表达减少;沉默HIF-1α后Hippo通路蛋白表达无明显变化,然而沉默YAP可以明显抑制YAP、pYAP、TEAD 及 HIF-1α 的表达。结论:1.胰腺癌肿瘤组织中HIF-1α高表达,并且和YAP的mRNA水平呈正相关。2.缺氧通过调控EMT相关蛋白、MMP2及MMP13促进胰腺癌的侵袭。3.缺氧可以诱导YAP核转运导致Hippo通路的失活。4.缺氧条件下,YAP可以转录激活HIF-1α表达,通过EMT及MMPs介导的肿瘤微环境重构,促进胰腺癌的侵袭。第四部分Hippo通路抑制剂维替泊芬诱导胰腺癌细胞凋亡和抑制血管生成的机制研究研究目的:通过体内外实验研究Hippo通路抑制剂维替泊芬对胰腺癌细胞增殖、凋亡和血管生成的影响,并探索相关分子机制。研究方法:1.通过CCK-8实验检测不同浓度维替泊芬对胰腺癌细胞活力影响;通过流式细胞技术检测维替泊芬对细胞周期影响;通过克隆形成实验检测维替泊芬对细胞增殖能力的影响。2.通过透射电镜、TUNEL染色及流式细胞技术检测维替泊芬对胰腺癌细胞凋亡的影响。3.Western Blot检测不同浓度维替泊芬处理胰腺癌细胞后,对细胞周期蛋白cyclinD1 和 cyclinE1,凋亡相关蛋白 PARP、cleaved PARP、Bax 及 Bcl-2,Hippo通路YAP、pYAP及TEAD蛋白的影响。4.通过Transwell、小管形成实验验证维替泊芬对HUVECs的血管生成能力的影响,Western Blot检测Ang2的表达。5.通过Transwell、小管形成实验检测维替泊芬对胰腺癌血管生成拟态的影响;Western Blot检查血管拟态标记物VE-cadherin、α-SMA及MMP2的表达。6.裸鼠成瘤实验验证维替泊芬对胰腺癌皮下移植瘤细胞凋亡、血管形成及血管生成拟态的影响;免疫组化染色cyclinD1、cyclinE1、Ki67、Ang2、VE-cadherin、α-SMA、MMP2、CD31 等指标;TUNEL 染色检测凋亡及 PAS/CD31双染检测血管生成拟态。研究结果:1.维替泊芬能够抑制细胞存活,并呈时间及浓度依赖;维替泊芬还可以抑制细胞增殖,同时将胰腺癌细胞阻滞在G1期,减少S期细胞。2.维替泊芬可以诱导胰腺癌细胞凋亡。3.维替泊芬抑制细胞周期蛋白cyclinD1和cyclinE1,诱导凋亡相关蛋白cleavedPARP、及Bax表达增加,还可以抑制Hippo通路YAP、pYAP及TEAD蛋白的表达,呈浓度梯度依赖。4.维替泊芬可以抑制HUVECs的血管生成能力,也可以抑制胰腺癌细胞的血管生成拟态;维替泊芬抑制了 Ang2、VE-cadherin、α-SMA及MMP2的表达。5.体内实验证实维替泊芬处理组肿瘤瘤重、体积小于对照组;免疫组化示维替泊芬组 cyclinD1、cyclinE1、Ki67、Ang2、VE-cadherin、α-SMA、MMP2、CD31表达减少,血管拟态减少,凋亡指数增加。结论:1.维替泊芬可以抑制细胞增殖,将其阻滞在G1期,并诱导细胞凋亡。2.维替泊芬可以通过抑制YAP蛋白表达,调控细胞周期及凋亡相关蛋白表达。3.体内外实验证实维替泊芬可以通过抑制Ang2表达,抑制血管生成;通过抑制VE-cadherin、α-SMA、MMP2表达影响肿瘤血管生成拟态。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.9

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