基于UPS与（抑）癌基因交互作用的肿瘤靶向治疗策略与调控机制初探

发布时间：2018-02-16 07:25

  本文关键词： 慢性粒细胞白血病 耐药 BCR-ABL 嵌合泛素连接酶 靶向降解 前列腺癌 MIIP 细胞侵袭 上皮-间充质转化 蛋白酶体活性　出处：《第四军医大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分:嵌合泛素连接酶SH2-U-box靶向降解慢粒白血病中BCR-ABL及其突变的治疗策略【研究背景】泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-Proteasome System,UPS)是真核生物内蛋白质降解的主要途径。通过促进底物蛋白质的泛素化降解,UPS参与调控几乎所有的细胞内过程,包括细胞增殖、分化、凋亡、复制、转录等。在生理状态下,UPS的正常运行对于细胞稳态和功能维持至关重要,UPS异常与多种人类重大疾病如肿瘤、神经退行性变密切相关。因此,基于UPS的疾病治疗策略一直方兴未艾。UPS介导的蛋白质降解过程包括蛋白质泛素化和蛋白酶体降解两个环节。在泛素激活酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3三种酶的协同作用下,由ATP供能,泛素分子(Ubiquitin,Ub)以共价键与底物蛋白质结合使后者发生泛素化。通常K48-多聚泛素链作为蛋白质降解信号,促使被修饰的蛋白质在蛋白酶体中降解。由于E3含底物识别结构域/亚基,可特异性识别并结合底物蛋白质,决定着蛋白质泛素化降解的特异性。利用E3的上述特性,通过精心设计和人为改变其底物识别特异性,理论上能够实现降解任意蛋白质,这一从蛋白质水平调控目的蛋白质含量的策略被喻为“靶向性蛋白质敲除”,在蛋白质功能研究以及疾病相关蛋白质靶向治疗策略中极具应用前景。以肿瘤相关蛋白作为分子靶点一直是肿瘤靶向性治疗研究领域的热点,其他研究者和我们一直在积极尝试和探索多种靶向性降解消除致癌蛋白的新策略。慢性粒细胞白血病(Chronic myeloid leukemia,CML)是一类发生于造血系统的克隆型疾病,其标志性特征是由染色体易位产生融合基因Bcr-Abl,编码致癌性BCR-ABL融合蛋白。BCR-ABL具有持续过度活化的酪氨酸激酶活性,通过募集Grb2(growth factor receptor-bound protein 2)等接头蛋白,激活下游PI3K-Akt、MAPK、STAT5等多条信号通路,导致细胞过度增殖等恶性行为。因此,BCR-ABL也是CML治疗的重要靶分子。针对BCR-ABL的第一代酪氨酸激酶抑制剂Imatinib尽管对始发CML的疗效令人鼓舞,但随之出现的Imatinib耐药成为了CML治疗所面临的突出问题。导致Imatinib耐药的主要原因是发生于BCR-ABL激酶区的点突变,这些突变多达40余种,其中以BCR-ABL T315I最为常见和难治,对第二代抑制剂如达沙替尼甚至第三代抑制剂如伯舒替尼均耐药。因此,寻找针对BCR-ABL及其突变的新策略仍然是治疗CML的挑战。【研究目的】本研究中我们以CML中的致癌蛋白BCR-ABL及其耐药突变体作为靶点,通过将能够识别并结合BCR-ABL及其耐药突变的Grb2 SH2结构域与E3泛素连接酶CHIP的催化结构域U-box进行融合,构建嵌合泛素连接酶SH2-U-box,以实现特异性泛素化、降解BCR-ABL及其耐药突变体,进而抑制CML并克服Imatinib耐药。【实验方法与结果】1.嵌合泛素连接酶SH2-U-box能够与BCR-ABL及T315I结合,并促进其泛素化降解将能识别和结合BCR-ABL及其突变的SH2结构域与具有E3催化功能的结构域U-box通过重组PCR融合,构建为嵌合泛素连接酶SH2-U-box,以SH2(不含U-box)作为对照。通过电转的方式导入表达BCR-ABL的K562细胞及其耐药细胞株K562R(含T315I),Western blot结果表明,与对照相比SH2-U-box能够显著下调BCR-ABL及其突变T315I的蛋白水平;Real-time PCR结果则表明上述分子m RNA水平并未发生变化。将表达SH2-U-box或SH2的质粒p FLAG-CMV4、与表达BCR-ABL或T315I的质粒pc DNA3.1(-),共转染至293T细胞中,免疫共沉淀实验表明SH2-U-box和SH2均能够与BCR-ABL或T315I结合;泛素化实验则表明:SH2-U-box能够显著提高靶分子的泛素化,但SH2不具有该作用。CHX蛋白追踪实验表明SH2-U-box较SH2明显缩短BCR-ABL及T315I的半衰期,且该作用可被蛋白酶体抑制剂MG132削弱。2.SH2-U-box稳定表达可下调BCR-ABL及其下游信号通路,抑制K562及K562R的生长,在K562中与Imatinib具有叠加作用进一步利用慢病毒系统建立了稳定表达e GFP,SH2或SH2-U-box的K562/K562R细胞,在这些细胞中采用Western blot证实SH2-U-box促进BCR-ABL及T315I的降解,下调其磷酸化水平;BCR-ABL下游STAT5、PI3K-Akt、MAPK信号通路的活化以及抗凋亡分子Bcl-x L均受到抑制。上述细胞稳定表达SH2-U-box、SH2或e GFP的K562/K562R细胞,以Imatinib处理或不处理,采用CCK-8检测细胞活力。结果表明,与对照e GFP组相比,SH2-U-box而非其SH2,能够显著抑制K562和K562R的生长。在K562细胞中,SH2-U-box与Imatinib联用能够协同抑制细胞增殖。过表达SH2-U-box或SH2的K562和K562R细胞施以Imatinib处理,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。结果表明,SH2-U-box表达可增加K562和K562R细胞G1期、降低S期比例,并促进细胞凋亡;在K562细胞中,SH2-U-box同样表现出与Imatinib的协同作用。3.SH2-U-box能够在动物水平抑制K562及K562R皮下移植瘤的生长,并能抑制CML临床病人原代细胞的生长我们分别在裸鼠和重症免疫缺陷小鼠建立了K562和K562R的皮下荷瘤模型,待瘤体可见时,施以SH2-U-box或SH2慢病毒瘤体原位注射,监测肿瘤生长情况。结果表明SH2-U-box处理组的肿瘤生长速度和瘤体质量明显小于SH2组。瘤体组织蛋白的Western blot结果显示:与体外实验结果一致,SH2-U-box处理组BCR-ABL及下游信号p-STAT5,p-Akt,p ERK等均抑制,SH2-U-box处理组可检测出PARP切割条带。瘤体组织的免疫组化结果表明SH2-U-box组的瘤体组织中Ki-67阳性较SH2处理组明显降低。利用梯度离心法从两例CML确诊病人的骨髓中提取单核细胞和粒细胞。以携带SH2-U-box或SH2慢病毒感染原代细胞,CCK-8检测细胞活力表明SH2-U-box能够明显抑制原代细胞的增殖,Western blot检测结果表明在原代细胞中,SH2-U-box能够明显下调BCR-ABL和p-BCR-ABL及下游信号p-STAT5,p-Akt。【结论】SH2-U-box能够有效结合BCR-ABL及耐药突变BCR-ABL(T315I),促进它们发生泛素化并在蛋白酶体中降解,进而削弱相应的下游信号通路;从而抑制CML及其耐药细胞的增殖,促进肿瘤细胞的凋亡;在K562细胞中,SH2-U-box还能够与Imatinib联用协同抑制肿瘤;动物实验和原代CML实验亦表明,SH2-U-box能够抑制CML生长。该研究丰富和完善了靶向泛素化、降解致病相关蛋白这一治疗策略的理论基础,并为BCR-ABL阳性尤其是对已有治疗方案耐药的CML治疗提供了新思路和方法。第二部分:MIIP与UPS交互作用探索及其在前列腺癌发生发展中的作用与机制【研究背景】前列腺癌(Prostatecancer,PCa)是男性最常见的恶性肿瘤,根据最新的统计结果,PCa位居男性肿瘤发病率第二、死亡率第六。尽管手术、激素治疗以及放化疗在临床已经广为应用,但对于进展期和转移PCa仍缺乏较好的治疗方案。因此阐明PCa发生发展和转移的分子机制,寻找新的干预策略,一直是PCa基础和临床研究的焦点。MIIP(Migration and Invasion Inhibitory Protein)是研究者最早在胶质瘤中报道的IGFBP2的相互作用分子,因其具有抑制肿瘤细胞迁移侵袭作用而命名。MIIP基因位于染色体1p36.22,在乳腺癌、胰腺癌、胶质瘤、前列腺癌等多种肿瘤中都检测到了该段染色体的缺失。MIIP编码的蛋白由388个氨基酸构成,包含RGD结构域和几个潜在磷酸化位点。已有的研究表明,MIIP在胶质瘤、结肠癌、子宫内膜癌等多种肿瘤中低表达,通过与不同分子结合,调控细胞周期、细胞侵袭、染色体不稳定性等肿瘤恶性特征,抑制肿瘤进展,提示MIIP具有抑癌功能,但在不同类型肿瘤中,其作用环节和机制远未阐明。UPS(Ubiquitin-Proteasome System)异常、EMT(Epithelial-Mesenchymal Transition)等在肿瘤发生发展中的作用已被广泛认可,并逐渐成为肿瘤治疗的重要干预靶位。一些抑癌基因产物可通过直接或间接调控上述过程而发挥抑癌功能。研究表明前列腺癌特别是去势抵抗阶段肿瘤细胞蛋白酶体活性明显升高,但其具体的调控方式和机制并不清楚。【研究目的】本部分研究中,我们初步探索了MIIP对UPS的调控作用以及对前列腺癌细胞增殖、侵袭、EMT等恶性生物学行为的影响。从临床标本、前列腺癌细胞系、荷瘤鼠四个层面研究了MIIP的抑癌作用。【实验方法与结果】1.MIIP在PCa组织中低表达我们对21例前列腺癌患者的组织中检测MIIP的蛋白水平,MIIP在半数以上(11/21)的患者癌组织中较癌旁组织下调,其中7例MIIP表达的下调较为明显。2.MIIP能够抑制PCa细胞蛋白酶体活性为明确MIIP在前列腺癌中的作用,我们建立了稳定表达MIIP的C4-2和LNCap细胞系,CCK8细胞活力检测表明MIIP可抑制细胞生长,蛋白酶体活性检测发现MIIP过表达能够明显抑制PCa细胞的Chymotrypsin-like活性。3.MIIP抑制PCa细胞的生长和侵袭,抑制肿瘤细胞的EMT我们在DU145和PC3细胞中,通过转染MIIP过表达质粒和MIIP si RNA调变MIIP。MTT、克隆形成、Transwell侵袭实验表明MIIP过表达明显抑制DU145和PC3细胞增殖、克隆形成能力和侵袭能力,而MIIP敲低则相反。Western blot结果表明敲低MIIP能够显著抑制上皮标志E-cadherin的表达,同时上调间充质标志N-cadherin,Vimentin的表达。Real-time PCR结果也表明敲低MIIP后,CDH1(编码E-cadherin)和CDH2(编码N-cadherin)的变化与蛋白质一致,SNAI1,SNAI2以及TWIST1的m RNA水平也有所上调。在MIIP过表达的DU145和PC3中,E-cadherin的蛋白水平上调而N-cadherin则下调。4.稳定敲低MIIP促进裸鼠体内的前列腺癌移殖瘤生长我们利用MIIP sh RNA慢病毒建立了稳定敲减MIIP的DU145和PC3细胞系,MIIP稳定敲低的细胞在显微镜下表现为间充质样并分散生长,Western blot和real-time PCR表明MIIP稳定敲低对EMT标记分子以及SNAI1等的影响与瞬时敲低一致。裸鼠皮下注射上述细胞系建立荷瘤模型,监测肿瘤生长,发现MIIP稳定敲低的DU145和PC3生长与对照相比较快,30天后MIIP稳定敲减组的瘤体质量也较重。瘤体组织的Western blot实验表明MIIP敲低的瘤体组织中MIIP表达较低,免疫组化结果表明MIIP敲低组中Ki-67阳性细胞数明显增多。【结论】本部分研究首次证实新近发现的抑癌基因MIIP在前列腺癌中通过调控EMT和UPS,抑制前列腺癌的恶性进程。我们发现过表达MIIP能够抑制PCa细胞蛋白酶体活性,并上调E-cadherin,下调N-cadherin以及促EMT的相关转录因子(snail,slug,twist),进而抑制前列腺癌细胞的侵袭。裸鼠皮下荷瘤模型表明敲减MIIP表达能够促进肿瘤生长。本课题将丰富前列腺癌中UPS、EMT的调控机制,揭示MIIP发挥抑癌功能的分子机制,为临床防治前列腺癌进展提供新思路。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R730.5
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本文编号：1514978