miR-335通过靶向生存素对食管癌细胞增殖及凋亡的影响及分子机制研究

发布时间：2018-02-16 18:50

本文关键词： 食管癌 miRNA-335 生存素靶控　出处：《郑州大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景:食管癌是临床常见恶性肿瘤之一。我国是食管癌高发国家,每年约有15万食管癌患者死亡,约占所有恶性肿瘤患者死亡总数的1/4。目前,关于食管癌发病机制的研究已取得较大进展,但仍未完全探明。外科手术是食管癌的公认根治性治疗手段,但由于食管癌起病隐匿,且临床症状缺乏特异性,故大部分食管癌患者就诊时已发展至晚期,从而导致其丧失了最佳手术时机。食管癌即使是早期,但对多数患者而言依然是致命性的,可切除的食管癌患者5年总生存率仅为24%左右。放疗、化疗可有效提高食管癌局部控制率,改善远期生存率,是食管癌临床治疗的重要辅助手段。以手术、放疗和化疗为主的多学科综合治疗,越来越广泛地运用于食管癌的治疗。但是放化疗具有严重的毒副反应,在杀灭肿瘤的同时也会对机体正常组织细胞造成损害,且食管癌患者的远期生存率也不尽人意。局部复发和远处转移是导致食管癌患者预后不良的主要因素,寻找更为有效的辅助治疗方法和治疗靶点抑制肿瘤局部复发和远处转移是临床亟待解决的重点及难点问题。微小RNA(micro RNA,mi RNA)是一类内源性单链小分子RNA。人体内的mi RNA可通过与靶基因3′-端非翻译区(3′-UTR)配对,实现对m RNA转录及翻译的调控,从而在肿瘤细胞分化、增殖、凋亡等过程中发挥重要作用。随着后基因组时代的到来,探索非编码序列的生物学意义越来越重要,在肿瘤的发生、发展中对于mi RNA的探索成为当前的研究热点。准确预测mi RNA的靶标基因,通过特异性调控mi RNA的表达可为恶性肿瘤临床诊断和治疗提供新思路。人类mi R-335定位于7q32.2,并与其下游多种基因存在靶控关系。研究证实,骨肉瘤、肺癌、胃癌等恶性肿瘤组织中存在mi R-335低表达现象,并导致其靶基因调控异常,进而为恶性肿瘤细胞增殖、分化提供有利条件。研究显示,mi R-335在胃癌细胞中低表达,上调mi R-335表达可有效抑制胃癌细胞侵袭及转移能力,提示mi R-335可能发挥抑制癌基因功能;但mi R-335在星形细胞瘤中呈高表达,并且促进细胞的增殖与侵袭,发挥着类似癌基因的功能。但mi R-335在食管癌中的表达及作用尚未完全明确。生存素(Survivin)作为一种凋亡抑制蛋白,具有多重生物学活性,参与肿瘤细胞增殖、凋亡过程,其可对抗有丝分裂期细胞的错误凋亡,并在细胞有丝分裂中起着重要作用。生存素的高表达也出现在包括食管癌在内的多种恶性肿瘤组织内。生物信息学基因组预测:生存素可能是mi RNA-335的靶向基因之一。但mi RNA-335是否可通过靶向调控生存素参与食管癌细胞增殖及凋亡过程尚未可知。目的:本研究旨在探讨mi RNA-335对食管癌细胞内生存素的靶向调控作用及其对食管癌细胞增殖和凋亡的调节机制,以期为食管癌的临床诊断及靶向治疗提供可靠依据。第一章mi R-335和生存素在人食管癌组织及细胞株中的表达变化方法:选取食管癌组织、癌旁组织及正常组织;选取人正常食管上皮细胞,食管癌细胞株Eca-109、TE-1、TE-13。分别采用RT-PCR检测组织和细胞中mi RNA-335表达,采用Western Blot法检测组织和细胞中生存素蛋白表达。结果:(1)与正常组织相比较,癌旁组织及食管癌组织mi R-335表达水平均显著降低,差异有统计学意义(P0.05);与癌旁组织相比较,食管癌组织mi R-335表达水平显著降低,差异有统计学意义(P0.05);(2)与正常组织相比较,癌旁组织及食管癌组织生存素蛋白表达水平均显著增高,差异有统计学意义(P0.05);与癌旁组织相比较,食管癌组织生存素的蛋白表达水平明显增高,差异具有统计学意义(P0.05);(3)与正常食管上皮细胞相比较,食管癌细胞株Eca-109、TE-1、TE-13中mi R-335 m RNA表达水平均显著降低,差异有统计学意义(P0.05);食管癌细胞株中以Eca-109的mi R-335表达下调最为明显,与TE-1、TE-13比较,差异有统计学意义(P0.05);(4)与正常食管上皮细胞相比较,食管癌细胞株Eca-109、TE-1、TE-13中生存素蛋白表达水平均显著升高,差异有统计学意义(P0.05);食管癌细胞株中以Eca-109的生存素蛋白表达上调最为明显,与TE-1、TE-13比较,差异有统计学意义(P0.05)。结论:食管癌组织及细胞中均呈现mi R-335 m RNA低表达现象;食管癌组织及细胞中均呈现生存素蛋白高表达现象。第二章mi R-335对食管癌细胞生物学特性影响的体外实验研究方法:选取食管癌细胞株Eca-109为研究对象,将细胞分为4组,即转染miR-NC precursor组(pre-mi R-NC)、转染mi R-335 precursor组(pre-mi R-335)、转染mi R-NC inhibitor组(anti-mi R-NC)和转染mi R-335 inhibitor组(anti-mi R-335)。转染24h后,采用RT-PCR检测mi RNA-335表达,生存素蛋白的表达采用Western Blot法检测,细胞增殖采用MTT法检测,采用克隆集落形成实验检测细胞集落形成率,采用流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期,采用Transwell小室实验检测细胞侵袭能力,采用划痕实验检测细胞迁移能力。结果:(1)与pre-mi R-NC组相比较,pre-mi R-335组中mi R-335表达水平明显上调,差异有统计学意义(P0.05);而与anti-mi R-NC组相比较,anti-mi R-335组中mi R-335表达水平明显下调,差异有统计学意义(P0.05)。(2)与pre-mi R-NC组相比较,pre-mi R-335组中生存素蛋白表达水平明显下调,差异有统计学意义(P0.05);而与anti-mi R-NC组相比较,anti-mi R-335组中生存素蛋白表达明显上调,差异有统计学意义(P0.05)。(3)MTT法检测结果显示,与pre-mi R-NC组相比较,pre-mi R-335组细胞增殖水平明显降低,差异有统计学意义(P0.05);而与anti-mi R-NC组相比较,anti-mi R-335组细胞增殖水平明显提高,差异有统计学意义(P0.05)。(4)克隆集落形成实验结果显示,与pre-mi R-NC组相比较,pre-mi R-335组细胞集落形成率明显降低,差异有统计学意义(P0.05);而与anti-mi R-NC组相比较,anti-mi R-335组细胞集落形成率明显明显提高,差异有统计学意义(P0.05)。(5)流式细胞仪检测结果显示,与pre-mi R-NC组相比较,pre-mi R-335组细胞凋亡率明显上调,差异有统计学意义(P0.05);而与anti-mi R-NC组相比较,anti-mi R-335组细胞凋亡率明显下调,差异有统计学意义(P0.05)。(6)流式细胞仪检测结果显示,与pre-mi R-NC组相比较,pre-mi R-335组细胞停留在G0/G1期的数目明显增加,差异有统计学意义(P0.05);而与anti-mi R-NC组相比较,anti-mi R-335组细胞阻滞在S期的数目明显增加,差异有统计学意义(P0.05)。(7)与pre-mi R-NC组相比较,pre-mi R-335组细胞侵袭数目明显减少,差异有统计学意义(P0.05);而与anti-mi R-NC组相比较,anti-mi R-335组细胞侵袭数目明显增加,差异有统计学意义(P0.05)。(8)与pre-mi R-NC组相比较,pre-mi R-335组细胞迁移距离明显缩短,差异有统计学意义(P0.05);而与anti-mi R-NC组相比较,anti-mi R-335组细胞迁移距离明显增加,差异有统计学意义(P0.05)。结论:调控食管癌细胞中mi R-335表达可影响生存素表达,从而影响食管癌细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移等生物学特性。第三部分mi R-335靶控食管癌中生存素的实验研究方法选取食管癌细胞株Eca-109为研究对象,将人工合成的survivin基因3’UTR区序列克隆至荧光素酶报告质粒,将重组荧光素酶报告质粒和mi RNA mimics共转染至Eca-109,采用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性。结果:荧光素酶报告基因检测结果显示,survivin-3'UTR预测基因质粒和mi RNA-335 precursor共转染组与survivin-3'UTR预测基因质粒和阴性对照共转染组相比较,转染组的荧光素酶表达明显下降,差异有统计学意义(P0.05)。结论:生存素是mi R-335在食管癌中的直接靶基因。
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【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.1

【参考文献】