Hiwi基因在乳腺癌中的表达及其对乳腺癌细胞生长的影响

发布时间：2018-02-26 02:28

  本文关键词： Hiwi基因 人乳腺癌 细胞生长 基因干扰　出处：《吉林大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一,发生率逐年升高,并有年轻化趋势。目前乳腺癌发病的病因及发病机制尚不完全清楚。Hiwi基因属于Piwi蛋白家族一员，基因定位于12号染色体，编码蛋白为98.5kd，在干细胞自我更新中发挥重要作用。最近研究表明, Hiwi基因在人口腔鳞状上皮癌、人胰腺癌、人胃癌以及肠癌等组织中异常表达，并与这些肿瘤的预后密切相关，高水平Hiwi蛋白表达也与肿瘤的低分化、侵润程度以及转移密切相关。因此，Hiwi基因被认为是与肿瘤发生发展密切相关基因之一。而乳腺癌组织中Hiwi是否高表达，Hiwi是否影响着乳腺癌的发生、发展,目前国内外尚无相关研究。 本研究目的是通过检测人乳腺癌组织以及乳腺癌细胞株中Hiwi基因及蛋白的表达,通过在乳腺癌细胞内过表达Hiwi基因以及抑制Hiwi基因表达等研究方法评价Hiwi基因对乳腺癌细胞生长的影响，探讨Hiwi基因与乳腺癌发生、发展之间的关系。 一、Hiwi基因在乳腺癌组织及细胞内高表达，与肿瘤的恶性程度有关 采集47例乳腺癌患者肿瘤组织及癌旁组织，体外培养MDA-MB-231、MCF-7与MCF-12A乳腺癌细胞系。提取肿瘤组织以及细胞系的总RNA，应用实时定量PCR技术进行Hiwi基因表达mRNA的检测，其检测结果进行临床病理学资料相关性研究；提取肿瘤组织以及细胞系的总蛋白，应用Western blot进行Hiwi基因表达蛋白检测。 实时定量PCR结果显示Hiwi基因mRNA在肿瘤组织样本表达明显高于癌旁组织样本。Hiwi基因mRNA表达与乳腺癌患者年龄及更年期无关，但与患者肿瘤大小、淋巴结转移和组织学分化有关。在大尺寸肿瘤、有腋窝淋巴结转移以及高分期的肿瘤组织内呈现高表达。Western blot分析15例样本的Hiwi基因蛋白表达，其结果显示Hiwi基因蛋白在肿瘤组织样本表达明显高于癌旁组织样本。与正常乳腺细胞相比，MDA-MB-231和MCF-7细胞内Hiwi基因mRNA与蛋白呈高表达，二者相比具有显著差异；而在MCF-12A细胞表达没有差异性。综上实验结果证实了Hiwi基因在肿瘤组织与肿瘤细胞内呈高表达。 二、Hiwi基因过表达促进乳腺癌细胞MCF-7生长 应用脂质体将质粒载体pcDNA3.1（+）与Hiwi-2A-eGFP-pcDNA3.1（+）转染入人乳腺癌细胞MCF-7，转染细胞通过G418进行稳定筛选。应用实时定量PCR与Western blot检测Hiwi基因的表达，通过细胞计数8天内细胞数目以及6天内细胞克隆生成能力检测，判定Hiwi基因过表达对MCF-7细胞生长的影响。 实时定量PCR检测结果显示在转染Hiwi基因的不同代系乳腺癌细胞MCF-7其Hiwi mRNA的表达均高于转染pcDNA3.1（+）细胞，Western blot检测结果显示在转染Hiwi基因的不同代系乳腺癌细胞MCF-7中Hiwi蛋白的表达呈高表达，均高于转染pcDNA3.1（+）细胞。 细胞计数在细胞接种后每隔1天完成共3次。结果显示转染Hiwi基因MCF-7细胞生长的速率明显高于转染pcDNA3.1（+）细胞，尤其在接种后的4-6天。细胞克隆实验显示转染Hiwi基因MCF-7细胞克隆细胞形成数目明显多于转染pcDNA3.1（+）细胞。 综上，我们实验证实在乳腺癌细胞株内过表达Hiwi基因产物能够促进乳腺癌细胞生长。 三、通过siRNA抑制Hiwi基因表达能够有效抑制乳腺癌细胞系生长 根据Hiwi基因序列设计靶向抑制该基因表达的siRNA序列，并在体外人工合成，通过脂质体转入Hiwi基因高表达的MCF-7细胞，应用实时定量PCR与Western blot检测Hiwi基因表达，，通过细胞计数6天内细胞数目以及6天内细胞克隆生成能力检测判定siRNA抑制Hiwi表达对MCF-7生长影响。 将靶向Hiwi基因siRNA应用脂质体转入MCF-7细胞24小时后，应用实时定量PCR以及转染48小时后应用Western blot进行Hiwi基因表达检测。其检测结果显示转染Hiwi siRNA的MCF-7细胞的Hiwi基因在mRNA以及蛋白水平表达受到抑制，与对照组相比明显下降，二者相比具有统计学意义。 将靶向Hiwi基因siRNA应用脂质体转入MCF-7细胞48小时后重新接种细胞，在不同时间段计数细胞，结果显示在接种第4-6天，转染siRNA的细胞生长受到抑制，与对照组相比具有显著性差异。细胞克隆实验显示转染siRNA的MCF-7细胞形成克隆细胞数明显低于对照细胞。 综上，通过siRNA抑制Hiwi表达能够有效抑制乳腺癌细胞系生长。 本研究通过检测Hiwi基因在乳腺癌组织以及乳腺癌细胞株内的表达，证实其在乳腺癌中高表达。通过Hiwi基因在肿瘤细胞的过表达以及siRNA抑制Hiwi基因在肿瘤细胞内表达两个方面证实Hiwi基因对乳腺癌细胞生长的影响。说明Hiwi基因起到了癌基因作用，成为乳腺癌治疗的新靶点。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9

【参考文献】

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本文编号：1536173