胃癌血清蛋白标记物的筛

发布时间：2018-02-27 07:46

本文关键词： 胃癌蛋白质组学蛋白标记物类载脂蛋白C-I 转甲状腺素蛋白类载脂蛋白C-III　出处：《郑州大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：1研究背景胃癌(Gastric Cancer)是世界上发病率最高的肿瘤之一,我国胃癌的发病率也居高不下。相对与国外而言我国的胃癌以局部进展期和晚期居多,早期患者较少,总体生存率明显低于国外。如何提高胃癌患者的早诊早治是目前国内研究的热点问题。因为早期胃癌没有明显的临床表现,胃癌的早期临床表现也常常与胃炎相混淆,所以大多数胃癌患者即使肿瘤发展至进展期或者晚期,也没有特异性临床症状出现,因而依靠临床表现诊断胃癌显然无法实现。目前在我国开展胃癌的早期诊治尚未有一种快捷、有效的方法。虽然在日本等国家胃镜筛查已经成为中年以上人群的体检项目,但由于检查费用高、存在一定痛苦及风险,在我国不能普及。一些常规的检测指标诸如CEA、CA199和CA724等用于消化道肿瘤检测的肿瘤标志性蛋白质,也由于在普通人群中筛查的敏感性和特异性均不高的原因只能用于部分胃癌患者的术后复发与转移的监测。目前寻找特异性肿瘤标记物,尤其是在外周血中寻找对于胃癌有明确特异性的标志性蛋白质分子具有很高的临床价值。蛋白质组学(Proteomics)的概念早在1994年即被澳大利亚的研究人员Williams等提出,并首先将这一研究方法应用于科学研究。它研究的是生物体在一定阶段所拥有的全部蛋白质,以及在生物体代谢的过程中不同蛋白质的变化。不仅包括单个细胞在受到某些调控因子后其拥有的全部蛋白质的差异性变化,也包括整个生物的机体在某些影响因素的作用下蛋白质的差异性变化。因为蛋白质作为基因转录的最终形式,不仅参与生命的的维持,更是调节生命活动具体形式的执行者。对于蛋白质谱的研究和完善有助于早期诊断某些疾病,也有助于研究治疗这些疾病的生物学靶点和药物。本研究从胃癌早期诊断入手,采用蛋白质组学研究方法对胃癌患者血清进行研究,以期寻找出特异性蛋白标记物,而有助于胃癌的早期诊断。再从可能出现的特异性蛋白质入手,探索新发现的蛋白质是否参与胃癌的生长调节,以及对此类蛋白的调节能否作为胃癌可能的治疗手段。本研究对象是胃癌患者的血清(分别是胃癌患者术前血清,胃癌患者术后血清)。拟通过表明增强激光解析电离飞行时间质谱(Surface enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,SELDI-TOF-MS)技术对三组胃癌血清以及正常血清进行比对,寻找差异表达蛋白,构造出差异表达蛋白质谱图,再运用聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamidegel electrophoresis,SDS-PAGE)技术对目标蛋白进行纯化分离后,对目标蛋白用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF/TOF)技术进行鉴定。最终确定胃癌患者血清中具有特异性的蛋白标记物,并通过细胞培养和动物实验研究明确其是否对胃癌细胞和组织的生长产生影响,为胃癌的诊断及临床治疗提供了可能和依据。2研究目的通过蛋白组学技术筛选并鉴定胃癌患者血清中可能存在的特异性蛋白标记物,通过细胞培养和动物实验研究明确其是否对胃癌细胞和组织的生长产生影响。3材料与方法3.1临床及实验资料本研究材料收集郑州大学附属肿瘤医院普通外科自2013年5月至2014年1月前来就诊的60例首诊胃癌患者,其中男性患者46例,女性患者14例,年龄42~84岁,平均年龄58±0.5岁。术前经胃镜活检病理证实为腺癌,CT、彩超等检查排除远处转移,且无手术禁忌拟行手术治疗,于术前入院和术后1月复查时各采集血清标本一次,分别设为术前组和术后组。所有患者采集标本前均未接受化疗、放疗等治疗,手术后病理再次确认为胃腺癌,组织病理分型,14例患者高分化型腺癌,21例中分化型腺癌,25例低分化型腺癌。病理学诊断均经过两位以上的病理学专家的证实。20例慢性萎缩性胃炎患者血清,40例健康志愿者血清。所有120例患者的血样标本均自清晨空腹状态下抽取,血液抽取后将血样放置于干燥试管中于室温下静置1小时使血液自然凝固,而后在离心机中以3000 r/min的速度进行离心15min,抽取离心沉淀后的上清液移至PE管中,再将提取物置入-80℃冰箱进行保存。本实验通过了河南省肿瘤医院伦理委员会的伦理审查,受试者均已签署知情同意书。本实验选取的MGC-803和HGC-27胃癌细胞株购买于中国医学科学院的上海细胞库。裸鼠BLAB/C nude购自北京维通利华动物技术有限公司,选用四-五周龄裸鼠,雌性20只,雄性20只,体重12-15g。3.2主要试剂及仪器用于目标蛋白检测的蛋白质生物芯片系统(Ciphergen PBS II+SELDI TOF MS)以及WCX2蛋白芯片购买于美国Ciphergen Biosystem公司。SELDI TOF MS相关试剂购买于美国Sigma公司。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI TOF MS)购于美国Kratos Analytical公司。Apo C-I购买于中国泽溪源生物科技有限公司。真空冷却离心浓缩系统(SPD Speed Vac)购于美国Thermo Electron公司。1640培养基和DMEM培养基购于以色列BI公司,Mc Coy 5A培养基和胎牛血清购于美国GIBCO公司。胰蛋白酶购于中国索莱宝公司。荧光显微镜购买于日本Olympus公司。高速低温离心机购于日本HITACHI公司。Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System和Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell购于美国Bio-Rad Laboratories公司。IBM小Series360服务器(S/N:99WLWX4)购于美国IBM公司。鼠抗人血清(antiserum TTHY,一抗)、兔抗人血清(antiserum apo C-3,一抗)、抗鼠血清(二抗)和抗兔血清(二抗)购于美国santa cruz biotechnology公司。PVDF膜购于美国Millipore Corporation公司。3.3实验方法3.3.1胃癌血清蛋白标记物的筛选:随机选取40例胃癌患者和20例健康志愿者作为训练组,用以筛选特征蛋白;其余20例胃癌患者、20例慢性萎缩性胃炎患者和20例健康志愿者作为测试组,用以验证目标的有效性。采用SELDI-TOF-MS系统进行检测,以2000Da至20000Da为设定的最佳数据收集范围,收集实验所得到的每个样本中差异蛋白质的m/z峰值数据,采用Wilcoxon秩和检验,根据计算到的P值大小进行差异化分析,进而发现各组之间具有差异性的蛋白峰值。采用非线性支持向量机(SMV)分类器对各个样本质谱数据进行分析,建立判别模型,再采用留一法交叉验证测试组60例患者所建立模型的有效性。3.3.2胃癌血清差异性蛋白的纯化及鉴定:将处理好的血清标本用SDS-PAGE进行蛋白质的分离,切取相应的胶片部分,根据胶内酶解试剂盒说明书酶解出目标蛋白。点样在蛋白质芯片板上,采用MALDI-TOF/TOF进行鉴定,收集相应的肽质量指纹图谱。通过Mascot搜索软件,将采集的数据与Swiss Prot数据库进行连接、比对数据及匹配寻找相应的特征性蛋白质,从而获得相应的目标蛋白质。3.3.3胃癌血清差异性蛋白质标记物的验证:将待测样本根据BCA蛋白浓度试剂盒使用说明书采用微孔酶标仪法测定蛋白浓度,结果无明显差异,采用等体积法加样进行Western blot试验,扫描负片,采用image pro plus 6.0软件测定每条蛋白质负片的灰度,采用SPSS,version13.0统计软件进行各组间灰度值的统计学差异。3.3.4目标蛋白对胃癌细胞株增殖的影响:培养生长良好,处于对数增殖期的胃癌细胞。一组用不含目标蛋白培养基,作为对照组,另外五组加入含不同浓度目标蛋白的培养基,除此之外,加一组只有培养基100ul不含细胞。取在第24h后开始,每隔24h,每孔加入cck-8试剂10ul,孵育1.5h,在酶标仪中以450nm吸光值,检测其吸光度至72h。3.3.5目标蛋白对胃癌细胞株荷瘤小鼠瘤体的影响:选用BLAB/C Nude小鼠,雌性20只,雄性20只,体重12-15g。选用MGC-803细胞株,充分传代扩增,取对数期细胞消化后重悬计数,保证每只小鼠可以注射5x106个细胞(0.2ml)。注射细胞悬液0.2ml至裸鼠背部皮肤下。SPF级动物中心饲养,定期观察瘤体生长情况,测量裸鼠体重及瘤体大小,2周后分组给药。用1ml生理盐水溶解目标蛋白10mg,保证浓度(10mg/ml)。每只裸鼠给药剂量100mg/kg,给药途径选用尾静脉注射。连续给药5天,观察裸鼠生命体征,瘤体大小及体重变化。1周后处死裸鼠,收集瘤体,称重并测量瘤体大小,计算出抑制率。采用免疫组织化学方法检测瘤体Ki67,Bcl-2和Bax的表达。4结果4.1胃癌血清蛋白标记物的筛选结果对测试组60例标本的蛋白质谱数据经过分析处理后得到特异性m/z峰值(P0.01)15个。其中在正常组呈低表达的为8个,呈高表达的7个。通过SVM进行筛选Youden指数最高的组合模型得到了m/z峰位于6438、14222和8622的蛋白。m/z峰位于6438和14222的蛋白质在正常组和术后组均呈高表达,在术前组则明显低表达,m/z峰位于8622的蛋白在术前组呈高表达,在正常组和术后组呈低表达,联合检测此三种蛋白质,利用leave-1-out交叉检测,它们对胃癌患者和正常对照血清组的敏感性是97.12%,特异性是95.27%。盲法测试结果显示m/z峰位于6438、14222和8622的蛋白模型用于区分胃癌和非胃癌患者血清标本的敏感性为94.31%,特异性为93.68%,阳性预测值为95.12%。4.2胃癌血清蛋白质标记物纯化及鉴定的结果对含有m/z峰位于6438、14222和8622的蛋白质进行分离纯化,将得到序列片段通过Mascot搜索软件,与Swiss Prot数据库进行连接、比对、匹配,其分别属于载脂蛋白C-I(apolipoprotein C-I,Apo C-I),转甲状腺素蛋白(Transthyretin,TTHY),载脂蛋白C-Ⅲ(apolipoprotein C-Ⅲ,Apo C-Ⅲ)。4.3胃癌血清差异性蛋白质标记物的验证结果Western blot对胃癌患者术前组、术后组及正常对照组及的血清Apo C-I、TTHY和Apo C-III进行测定。对三组血清中目标蛋白质进行条带灰度值统计分析,结果为术前组与正常组蛋白质灰度差异有统计学显著性(P0.05),术前组与术后组蛋白质灰度差异有统计学显著性(P0.05)。4.4类载脂蛋白C-I对胃癌细胞株影响类载脂蛋白C-I对胃癌细胞株HGC27、MGC803的增殖产生明显的抑制作用,并且根据给药浓度和给药时间的增加呈现正相关的增殖抑制作用。4.5类载脂蛋白C-I对接种肿瘤细胞的荷瘤小鼠瘤体影响类载脂蛋白C-I对接种MGC803肿瘤细胞的荷瘤小鼠瘤体生长具有抑制作用,在对照组中肿瘤的重量为1.2+0.2g,而在实验组中肿瘤的重量为0.8+0.1g,抑制率为33.3%,统计学差异具有显著性(P0.05)。实验组中反应增殖的指标Ki67和Bcl-2表达量较对照组明显降低,而反映促凋亡活性的Bax呈现高表达。5结论1.m/z峰位于6438、14222和8622的蛋白质经过鉴定分别为Apo C-I、TTHY和Apo C-III,其表达强度变化与胃癌肿瘤负荷存在明显相关性,为后期研究特异性蛋白标记物与胃癌发生、发展的关系提供了新的思路。2.联合检测Apo C-I、TTHY和Apo C-III三种蛋白质可有效区分胃癌和非癌患者,对胃癌的血清学诊断具有一定的价值和应用前景。3.类载脂蛋白C-I对胃癌细胞株和胃癌细胞株荷瘤小鼠瘤体具有抑制作用,对后期研究两者的内在联系提供理论基础。4.类载脂蛋白C-I有可能作为一种新型的蛋白类抗肿瘤药,成为胃癌治疗的新型药物,也可能在其他类型肿瘤的治疗中发挥重要作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.2

【参考文献】