肝再生增强因子通过降低ABCB1和ABCG2的表达增强肝细胞癌对阿霉素的敏感性

发布时间：2018-02-27 16:26

本文关键词： ABCB1 ABCG2 肝再生增强因子肝细胞癌多药耐药性　出处：《首都医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景与目的:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球第五大最常见恶性肿瘤,而其致死率在恶性肿瘤中居于第三位。更为严峻的是,HCC患病率仍呈逐年上升趋势。近年来,由于影像学诊断技术的发展,HCC早期诊断率较过去显著提升,但其治疗效果依旧未能很好解决。根据肿瘤分期,HCC的治疗手段主要分为手术,放疗及化疗。由于HCC对多种化疗药物具有固有的多药耐药性(multidrug resistance,MDR),使其化疗效果一直不尽如人意。肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration,ALR),又称肝刺激因子(hepatic stimulator substance,HSS),最初被报道发现于肝部分切除术后的大鼠肝脏中,可以刺激肝脏再生。实验室及临床研究均证实ALR与多种肝脏疾病密切相关。近期发现,在肝硬化、胆管细胞癌及HCC患者的肝组织中,ALR基因及蛋白表达水平均呈升高态势。另外,有报道称在HCC患者中,ALR表达量与其肿瘤分级及转移性呈负相关。尽管已经有大量研究证明,HCC高转移特点与耐药性密切相关,但迄今,有关ALR是否与HCC耐药有关仍不甚明了。而本实验研究目的旨在探明ALR表达与HCC耐药性之关系并试图探究其机制。实验方法:1.为确信ALR表达与HCC耐药性之关系,本实验中使用了稳定转染ALR基因的HepG2细胞系(ALR-tx)及稳定敲减ALR基因的HepG2细胞系(ALR-sh RNA),并采用HepG2野生型细胞系Mock及稳定转染空载体的HepG2细胞系Vector-tx作为对照。以上细胞用不同剂量抗肿瘤药物---阿霉素(doxorubicin,0、0.5、1、2、4、8及16μg/ml)处理48 h后,测定细胞存活情况并计算半数抑制剂量(IC_(50))。并应用克隆抑制实验测定单个细胞药物处理后的增殖潜力。为进一步证实ALR基因表达与抗肿瘤效果的关系是否具有细胞特异性,本实验采用其他HCC细胞系(Bel-7402,Hep3B和Huh7),观察ALR转染与阿霉素引起的肿瘤生长抑制的关系。2.为进一步证实ALR与HCC耐药相关,本实验建立了裸鼠荷瘤模型。在NOD/SCID小鼠左侧腋下注射等量的ALR-tx或ALR-shRNA细胞,并在小鼠的右侧腋下注射等量的Mock细胞作为对照。腹腔注射给予阿霉素治疗(1.8 mg/kg/3q,即每3天给药)。治疗21天后,测量肿瘤的大小,并计算相对肿瘤体积及相对肿瘤增值率。并通过HE染色及透射电镜技术观察肿瘤的超微结构。3.为研究ALR促进HCC对阿霉素的敏感性是否与细胞凋亡相关,本实验采用阿霉素(1.88μg/ml)处理细胞24 h及48 h后,检测caspase活性,用western blot技术测定PARP剪切体的含量,并用流式细胞技术分析细胞凋亡情况。4.为进一步明确ALR表达与HCC耐药的机制,实验继续观察阿霉素在细胞内驻留情况。用不同剂量的阿霉素处理ALR-tx及ALR-shRNA的HepG2细胞及Bel-7402细胞2 h,用高内涵技术测定细胞内药物含量;并进一步利用激光共聚焦显微镜观察进入细胞内的药物含量。5.在确定ALR表达对HCC耐药的影响与阿霉素细胞内驻留有关之后,实验继续研究多药耐药相关转运蛋白(MDR-ABC)是否受到ALR的调节从而影响阿霉素细胞内驻留,本实验采用qRT-PCR技术测定细胞内部分MDR-ABC家族分子(ABCB1,ABCC1,ABCC10及ABCG2)mRNA表达量,并用western blot技术测定了细胞中及肿瘤组织中ABCB1与ABCG2的蛋白表达量。6.实验中,采用质粒转染技术,在ALR-shRNA细胞中重新表达ALR,并检测ABCB1和ABCG2的表达,进一步判定ALR基因表达参与调节ABCB1与ABCG2分子,从而阻止抗癌药物在HCC细胞外排。并通过共聚焦显微镜和高含量分析仪测定阿霉素的细胞内含量的变化。7.实验测定了当细胞ALR含量变化时,Snail及磷酸化AKT的变化情况,初步探索了ALR是否通过调节AKT/Snail/MDR-ABC途径影响ABCB1及ABCG2的表达。实验结果:1.ALR-shRNA细胞的IC_(50)(2.90μg/ml)显著高于Vector-tx(1.88μg/ml)细胞,而ALR-tx细胞IC_(50)值(1.25μg/ml)则明显降低。在应用1.88μg/ml阿霉素处理细胞48 h后更换完全培养基培养14 d后,ALR-shRNA细胞的克隆形成率为ALR-tx细胞的4倍。其他HCC细胞系中也存在转染ALR后,肿瘤细胞对阿霉素敏感性增高的现象。2.在裸鼠荷瘤试验中,在经阿霉素治疗后,Mock组的肿瘤生长抑制率为54.12%,ALR-tx组的肿瘤生长抑制率达到82.37%,而ALR-shRNA组的肿瘤生长抑制率仅为9.94%。光镜下观察各组肿瘤组织切片,经过阿霉素治疗后,Mock组肿瘤组织切片随处可见局灶性坏死,ALR-tx组坏死呈大片状,与此相反,ALR-shRNA组坏死较轻。透射电镜显示,经过阿霉素治疗后,Mock组肿瘤组织细胞内可见细胞核出现凋亡核型,ALR-tx组已基本不能分辨细胞结构,核膜破裂,核溶解的现象十分明显,与此相反,ALR-shRNA组凋亡及坏死较少。3.Caspase 3活性测定显示,经1.88μg/ml阿霉素处理24 h后,ALR-tx细胞caspase 3活性明显升高,约为处理前的2.3倍,其余各组细胞的caspase活性则未见明显变化;经过1.88μg/ml阿霉素处理48 h后,各组细胞caspase 3活性均出现明显上升,其中ALR-tx细胞上升最为明显,为处理前的3.3倍,ALR-shRNA细胞caspase 3活性为处理前的2.0倍,对照组细胞caspase 3活性为处理前的2.7倍。PARP剪切体含量测定显示,经1.88μg/ml阿霉素处理24 h后,ALR-tx细胞PARP剪切体含量上升最为明显,为处理前的2.5倍;处理48 h后,ALR-shRNA细胞PARP剪切体含量最少,为处理前的3.5倍,同时ALR-tx细胞PARP剪切体含量则为处理前的4.5倍。流式细胞技术分析显示,阿霉素处理24 h后,Mock组细胞和Vector-tx组细胞的凋亡率分别增加了20.3%和11.5%,同时,ALR-tx组细胞的凋亡率增加了38.3%。阿霉素处理48 h后,Mock组细胞和Vector-tx细胞的凋亡率分别达到了32.7%和28.9%,ALR-tx组细胞的凋亡率则达到了39.4%。4.高内涵技术定量分析细胞内药物含量显示,在不同药物剂量下,ALR-tx组细胞内阿霉素含量与Vector-tx细胞内荧相比明显升高;而ALR-shRNA细胞内药物含量明显低于Vector-tx细胞。而在经过3μM维拉帕米预处理1 h后,各组细胞内阿霉素含量均有一定程度的升高。5.ALR-shRNA细胞ABCB1的mRNA水平为ALR-tx细胞的3倍;ABCG2水平为ALR-tx细胞的4倍;而ALR-tx细胞与ALR-shRNA细胞的ABCC1及ABCC10水平无明显差异。Western blot结果显示,ALR-tx细胞ABCB1蛋白表达量为Vector-tx细胞的60%,ABCG2蛋白表达量为Vector-tx细胞的65%;ALR-shRNA细胞ABCG2蛋白表达量为Vector-tx细胞的2.3倍。6.挽救实验证实,向ALR-shRNA细胞中转染ALR质粒后,可以看到ALR的蛋白表达量有了明显上升;同时,ABCB1及ABCG2的蛋白表达量均较转染前及转染空载体组有所下降,其中ABCB1下降了39.7%,ABCG2下降了33.6%。激光共聚焦显微镜观察细胞内阿霉素含量,可见当ALR-shRNA细胞转染ALR质粒后,细胞内阿霉素含量明显升高,而转染空载体的细胞则没有这种现象。高内涵分析显示当ALR-shRNA细胞转染表达ALR的质粒后,细胞内阿霉素含量约为转染前的2倍。7.Western blot结果显示,ALR-tx细胞Snail蛋白表达量为Mock细胞的80%,p-AKT T308位点磷酸化水平降低。ALR-shRNA细胞Snail蛋白表达量为Mock细胞的1.2倍,p-AKT T308位点及S473位点磷酸化水平升高。结论:于HCC中转染ALR基因可以显著抑制HCC细胞的耐药性,其机制可能与ALR抑制AKT磷酸化及Snail活化,进而减弱ABCB1和ABCG2转录与翻译,从而增加诸如阿霉素等抗癌药在癌细胞滞留有关。本研究结果提示,ALR基因有可能成为提高HCC化疗疗效的潜在靶分子,用于改善HCC治疗及其预后。
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【学位授予单位】：首都医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.7

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