胶质瘤细胞中PIWIL1和miR-154-5p的生物学作用及其机制研究

发布时间：2018-03-01 06:38

  本文关键词： 胶质瘤 干细胞相关蛋白 PIWI样蛋白1 miR-154-5p 增殖 凋亡 侵袭 迁移　出处：《天津医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的PIWIL1是多种常见恶性肿瘤的癌基因,其异常高表达与肿瘤生物学进展密切相关。本研究旨在探讨PIWIL1及其上游潜在调控基因miR-154-5p对胶质瘤细胞生长、凋亡、迁移、侵袭等生物学特性的作用及相关机制,进而为胶质瘤的分子诊断和治疗提供新的分子标志物和靶点。方法1.实时定量PCR和Western Blot技术检测胶质瘤组织,非肿瘤脑组织和胶质瘤细胞系(SNB19,U87,A172,LN229,U251,LN308)中PIWIL1在mRNA和蛋白水平表达情况,同时利用实时定量PCR检测上述标本中miR-154-5p的表达水平。2.通过小RNA干扰(RNAi)技术,降低胶质瘤细胞U251和A172中内源性PIWIL1的表达后对胶质瘤细胞生物学特性的影响。利用实时定量PCR和Western Blot技术验证转染沉默效率,采用MTT、平板克隆集落形成实验、流式细胞仪技术,体外迁移和侵袭实验检测降低胶质瘤细胞U251和A172中内源性PIWIL1的表达后对胶质瘤细胞增殖、周期、凋亡、迁移和侵袭的影响。3.利用Western Blot技术检测降低胶质瘤细胞U251和A172中内源性PIWIL1的表达后对胶质瘤细胞增殖、周期、凋亡迁移和侵袭等相关基因(Bcl-2、Bax、CyclinD1、p21、MMP-2和MMP-9)的影响。4.构建裸鼠皮下荷U251人脑胶质瘤模型,采用多点注射PIWIL1-siRNA观察体内抑制效果,并通过免疫组化技术检测瘤块中PIWIL1的变化。5.将PIWIL1-siRNA和TMZ分别及联合作用于U251和A172细胞,然后采用MTT和流式细胞仪技术检测不同方式处理后细胞增殖和凋亡的变化。6.胶质瘤细胞U251和LN229分别转染miR-154-5p模拟体和抑制剂后,利用实时定量PCR技术检测转染效率,采用MTT、平板克隆集落形成实验、流式细胞仪技术,体外迁移和侵袭实验检测胶质细胞U251和LN229中miR-154-5p的表达改变后对细胞增殖、周期、凋亡、迁移和侵袭的影响。7.利用Western Blot技术检测改变胶质瘤细胞U251和LN229中miR-154-5p的表达后对胶质瘤细胞增殖、周期、凋亡、迁移和侵袭等相关基因(Bcl-2、Bax、CyclinD1、p21、MMP-2和MMP-9)的影响。8.生物信息学预测miR-154-5p的潜在靶基因,通过构建双荧光素酶报告质粒对潜在靶基因进行验证,通过挽救试验即转染PIWIL1真核表达质粒提高miR-154-5p转染细胞中相应蛋白的表达水平,以明确mi R-154-5p通过靶向PIWIL1影响胶质瘤细胞生物学特性。9.构建裸鼠皮下荷U251人脑胶质瘤模型,采用多点注射miR-154-5p模拟体观察体内抑制效果,并通过实时定量PCR检测瘤块中miR-154-5p和PIWIL1的变化,利用免疫组化技术检测瘤块中PIWIL1的表达情况。结果1.实时定量PCR和Western Blot技术检测显示,胶质瘤组织中PIWIL1的表达明显高于非肿瘤脑组织(P0.05),不同级别胶质瘤组织中PIWIL1的表达存在显著差异(P0.05),胶质瘤细胞系(SNB19,U87,A172,LN229,U251,LN308)PIWIL1表达明显高于非肿瘤脑组织,而胶质瘤组织中miR-154-5p的表达明显低于非肿瘤脑组织(P0.05),不同级别胶质瘤组织中miR-154-5p的表达存在显著差异(P0.05),胶质瘤细胞系(SNB19,U87,A172,LN229,U251,LN308)miR-154-5p表达明显低于非肿瘤脑组织(P0.05)。2.U251和A172细胞中内源性PIWIL1被降低后,细胞增殖活性受到显著抑制作用;细胞克隆集落形成率明显降低,诱导细胞周期阻滞在G1期,细胞的凋亡显著增加,显著降低胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力;相关基因的表达发生显著的变化:Bcl-2、CyclinD1、MMP-2和MMP-9表达降低,Bax和p21表达增强。进一步通过体内研究显示,PIWIL1-siRNA治疗能显著降低肿瘤生长的速度。3.PIWIL1-siRNA联合TMZ抑制细胞增殖,增加胶质瘤细胞对化疗药物的敏感性,促进胶质瘤细胞凋亡。4.过表达胶质瘤细胞中miR-154-5p的表达后,胶质瘤细胞的增殖活性受到显著抑制;细胞克隆集落形成率显著降低,细胞周期阻滞在G1期,诱导细胞凋亡率显著增加,细胞的侵袭和迁移能力明显降低;相关基因的表达也有显著的变化:Bcl-2、CyclinD1、MMP-2和MMP-9表达降低,Bax和p21表达增强。而抑制胶质瘤细胞中mi R-154-5p的表达后,胶质瘤细胞的增殖活性升高;细胞克隆形成率提高,细胞周期在G1期比例降低,细胞的凋亡显著减少,细胞的侵袭和迁移能力明显升高;相关基因的表达也有显著的变化:Bcl-2、CyclinD1、MMP-2和MMP-9表达升高,Bax和p21表达降低。进一步通过体内研究显示,miR-154-5p能显著抑制肿瘤的生长。5.生物信息学分析结果表明,PIWIL1基因为miR-154-5p的潜在靶基因。双荧光素酶报告系统实验结果表明,转染mi R-154-5p模拟体明显降低野生型PIWIL1 mRNA的3’UTR荧光素酶活性,而对突变型PIWIL1 mRNA 3’UTR无明显影响。挽救实验结果显示:升高细胞内PIWIL1表达水平后,可有效逆转miR-154-5p对胶质瘤细胞生长和迁移的抑制作用。结论从体内和体外水平对PIWIL1的促癌作用和mi R-154-5p的抑癌作用进行了验证,表明PIWIL1促进胶质瘤细胞生长和迁移,而miR-154-5p则起到抑制作用,且miR-154-5p发挥作用的可能机制是通过抑制胶质瘤细胞中PIWIL1的表达。进一步表明miR-154-5p的低表达和PIWIL1的高表达与胶质瘤的恶性进展密切相关,因此,miR-154-5p调控PIWIL1影响胶质瘤生物学特性,为恶性胶质瘤基因干预和分子靶向治疗新策略的制定奠定了理论基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R739.4

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本文编号：1550859