HSV2编码的microRNA分子靶向SOCS2促进肺癌细胞生存和转移

发布时间：2018-03-01 09:52

本文关键词： 肺癌转移 hsv2-miR-H9-5p 靶基因 SOCS2　出处：《第二军医大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：肺癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,也是目前对人类生命健康威胁最大的恶性肿瘤之一。随着我国工业化进程的发展、对环境的破坏以及北方地区日益严重的雾霾污染,肺癌已经成为我国第一大肿瘤,2012年统计数据显示肺癌发病率和死亡率分列男性肿瘤首位,女性肿瘤发病率的第二位和死亡率的第一位,且肺癌病人五年生存率低,80%的肺癌患者临床确诊时已经失去手术机会。肺癌易发生脑和骨的转移,其中肺癌骨转移是肺癌的主要并发症,主要症状包括疼痛、病理性的骨折和椎体转移的脊髓压迫以及高血钙和身体状况的下降等。肺癌患者出现脑、骨转移,会严重影响病人生存质量,因此在肺癌发生和发展过程中寻找和筛选与肺癌转移密切相关的因子对于肺癌病人的预后和生活质量密切相关。生物学研究已经发现miRNA分子是真核生物内源性编码的小RNA分子,主要参与了mRNA干扰现象,其作为重要的转录后调控因子在病毒、动物和植物等多物种的转录后mRNA沉默效应(Post-Transcriptional Gene Silencing,PTGS)中发挥着至关重要的作用。目前研究已经证实miRNA主要通过其成熟体序列中的种子序列与靶基因mRNA结合,造成mRNA降解或者抑制靶基因蛋白翻译进而瀑布样级联反应调控一个或多个基因的表达。目前对肿瘤发生和发展过程中相关miRNA的研究主要聚焦于人体内源性miRNA,而越来越多的研究表明外源性的miRNA尤其是病毒来源的miRNA在肿瘤发生和转移过程中也发挥着重要作用,病毒miRNA是病毒在感染人体过程中产生的具有RNA干扰效果的一类病毒来源的RNA分子。2004年在疱疹病毒家族中发现了首个病毒编码的miRNA后,渐多的研究证实病毒编码的miRNA能够靶向其自身的病毒来源的mRNA以调节其在感染过程不同阶段病毒蛋白的表达。近来有研究表明部分病毒来源的miRNA还可以通过靶向人体细胞内源性的基因来重塑细胞内环境,使其更适合感染需要,如已有报道Kaposi肉瘤相关的疱疹病毒KSHV可以利用病毒miRNA分子调节人体内源性基因的转录。本课题主要通过芯片筛选出肺癌骨转移过程中差异表达的miRNA分子,选择目的miRNA分子验证差异表达后,围绕病毒编码的miRNA分子hsv2-miR-H9-5p及其人体细胞内靶基因SOCS2在肺癌发生和发展过程中相互作用的分子机制和生物学功能开展初步和尝试性研究。第一部分肺癌骨转移相关的microrna筛选和差异表达验证目的:使用mirna表达谱芯片以原发性肺癌组织样本和肺癌骨转移组织样本对比筛查,筛选出肺癌转移相关的,在肺癌转移过程中出现异常表达的mirna分子。生物信息学分析结合文献查阅寻找有研究意义的目的mirna。扩大检测的样本量验证目的mirna存在差异性表达。方法:使用exiqon公司mirna表达谱芯片,以10例肺癌骨转移组织标本和10例原发性肺癌组织对比筛查,得到在肺癌转移过程中差异表达的mirna分子;使用实时荧光定量pcr实验验证目的mirna差异表达表达,并进一步扩大样本量验证芯片结果。结果:mirna分子肺癌骨转移过程中出现差异性表达。选择hsv2-mir-h9-5p作为研究的目的mirna。实时荧光定量pcr验证hsv2-mir-h9-5p差异性表达,进一步扩大样本量验证\其在原发性肺癌标本和肺癌骨转移标本中存在差异表达。结论:在肺癌骨转移过程中,mirna差异性表达表明其可能在肺癌转移过程中发挥作用。hsv2-mir-h9-5p表达差异较大,采用荧光定量pcr实验,验证芯片结果并进一步扩大样本量验证其存在差异表达。芯片结果和荧光定量pcr结果表明hsv2-mir-h9-5p可能在肺癌转移过程中发挥一定的功能,可以作为下一步研究的目的mirna分子。第二部分 hsv2-mir-h9-5p及其靶基因在肺癌细胞中功能研究目的:使用肺癌细胞株ltep-α-2和spc-α-1在细胞水平证实hsv2-mir-h9-5p在肺癌转移过程中具有生物学功能。探讨hsv2-mir-h9-5p与靶基因的相互作用和可能的调控机制。研究hsv2-mir-h9-5p靶基因socs2的生物学功能。方法:transwell小室检测hsv2-mir-h9-5p对肺癌细胞迁移能力的影响;transwell小室基质胶侵袭实验检测其对肺癌细胞侵袭能力的影响;生物信息学分析(mirdb,rnahybrid,targetscan等)结合rna芯片确定hsv2-mir-h9-5p的靶基因,双荧光素酶报告基因验证靶基因并从mrna水平和蛋白质水平确认靶基因表达水平的改变;研究靶基因SOCS2对肺癌细胞LTEP-α-2和SPC-α-1的生物学行为的影响。结果:迁移实验结果表明hsv2-miR-H9-5p促进肺癌细胞迁移能力;基质胶侵袭实验结果表明hsv2-miR-H9-5p促进肺癌细胞对基质胶的侵袭能力;使用细胞增殖和活性检测试剂盒CCK-8检测发现,相对于negative control,hsv2-miR-H9-5p mimic促进了肺癌细胞LTEP-α-2和SPC-α-1增殖能力;使用流式细胞仪进行的凋亡检测发现hsv2-miR-H9-5p增强了肺癌细胞的抗凋亡能力;细胞周期分析未见明显区别;双荧光素酶报告基因验证实验表明SOCS2是hsv2-mi R-H9-5p靶基因之一,实时荧光定量PCR实验和Western Blot实验分别在mRNA水平和蛋白质水平进一步证实SOCS2为hsv2-miR-H9-5p靶基因;SOCS2生物学功能研究发现SOCS2在细胞水平削弱肺癌细胞的迁移和对基质胶的侵袭能力,抑制肺癌细胞的增殖,促进肺癌细胞凋亡。结论:研究表明hsv2-miR-H9-5p能够促进肺癌细胞的恶性表型,促进肺癌细胞的迁移和侵袭能力,靶基因SOCS2 mRNA 3’UTR区是外源性病毒来源的hsv2-miR-H9-5p的特异性调控位点,并且靶基因SOCS2在mRNA和蛋白质层面表达水平受到hsv2-mi R-H9-5p的调控。蛋白质编码基因SOCS2的功能在胃癌、乳腺癌、前列腺癌等肿瘤中已有研究,在不同肿瘤中其功能也有所不同,在本课题研究过程中使用的两株肺癌细胞系LTEP-α-2和SPC-α-1中,发现其对肺癌细胞的的恶性生物学行为起到了抑制作用。我们的研究从细胞层面证实病毒感染人体之后可通过其自身编码的miRNA分子从基因转录调控层面对细胞内源性基因进行调控提供了直接证据,并且进一步加深了对在肺癌发生和进展过程中病毒及其编码的miRNA分子调控的生物学机制的理解。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R734.2

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