胆汁酸在Barrett食管发病机制中作用的研究

发布时间：2018-03-03 07:42

本文选题：胆汁酸受体　切入点：动物模型　出处：《山东大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景与目的：Barrett食管(Barrett's esophagus, BE)是一种癌前病变,是指正常食管鳞状上皮被包含杯状细胞的柱状上皮所取代的一种病理现象。BE发生与食管慢性炎症刺激相关,BE引起的细胞转化,是食管腺癌的重要重要致病因素。目前已经证实导致BE发生的一个重要因素是慢性胃食管反流症(GERD).5-10%的胃食管反流患者在内镜下发现Barrett食管。研究表明,十二指肠-胃-食管反流在BE的发病机制中起着重要作用。食管鳞状上皮细胞长时间受返流液刺激可能使食管粘膜内胆汁酸易感受体异位表达,促进产生BE并进一步发展为食管腺癌,又称之为Barrett's腺癌(BA)。BE患者发生食管腺癌的风险要比正常人高。而且,在过去的几十年中,BA的发生率有明显的增长。但是BE发生发展过程中的发病机制尚不清楚,以往通过体外细胞培养方式研究化生及肿瘤发生的分子机制,但是由于机体内免疫系统的复杂性,尚不能很好地反映生物体内食管粘膜由鳞状上皮到BE甚至食管腺癌的过程。以往研究表明引起食管损伤及炎症最重要的因素是胃反流物中的胃酸及胃蛋白酶。长期暴露于胃酸及消化酶的环境中,食管粘膜受到损伤,并发生柱状上皮化生,进而替代正常的食管鳞状上皮。最近研究发现反流液中胆汁酸盐在食管粘膜损伤及化生中起到重要作用。一些临床研究检测表明BE患者中胆汁酸盐反流更为常见,BE患者食管内胆汁酸盐浓度明显高于单纯的胃食管反流患者。另外有体内及体外实验证明胆汁酸盐在BE的发生过程中具有促进作用。胆汁酸通过与其受体结合而发挥作用,胆汁酸受体(FXR)的变化与肿的发生发展有关,研究发现FXR在BE组织中高表达,提示胆汁酸及其受体在BE发生发展过程中可能发挥重要作用。BE化生过程通常伴随肠道特异性基因的表达,在食管粘膜肠上皮化生过程中的一个初始诱导基因是CDX-2。CDX-2是肠道特异性表达的核转录因子,其基因表达增强往往与胃肠道粘膜上皮化生和异形性增生以及肿瘤的发生相关。另外体外细胞的研究发现,CDX-2具有诱导细胞分化的作用,而且研究证实CDX-2与Muc2启动子相互作用并激发其转录,从而在杯状细胞分化中起到重要作用。在胃食管反流液慢性刺激下食管扁平鳞状上皮区域出现CDX-2及Muc2表达,可以证实食管粘膜已经在致病因素的作用下启动化生过程。胆汁酸盐的致癌作用与其引起食管粘膜的慢性炎症反应有关,临床研究发现BE上皮细胞中促炎基因如COX-2、PPAR-g、促炎细胞因子等表达上调,粘膜炎症程度加重以及BE发生率与组织中PGE2水平的升高显著相关,COX-2是PGs合成中的关键性限速酶,COX-2高表达后能够引起食管粘膜组织中前列腺素E2(PGE2)水平升高,粘膜的炎症程度相应加重。另外研究认为慢性炎症可能通过促进释放氧自由基(ROS)引起的氧化应激而引起BE的发生发展,各种炎性介质诱导ROS释放,因此导致食管粘膜持续慢性氧化应激损伤,并随着食管炎症加重,Barrett食管及腺癌的发生率相应升高。另外,在BE化生及肿瘤发生过程中伴随着一系列信号蛋白、转录因子等表达,如Bmp4、Tff2、Krt19等。Bmp4作为BE上皮的标志性蛋白,胆汁酸可以通过Bmp4信号通路调节CDX-2的表达并促进食管鳞状上皮肠化生。Tff2对食管粘膜具有保护作用,促进损伤粘膜的修复,在炎性病变中上调表达,Krt19是上皮细胞的骨架蛋白,在上皮原发肿瘤中表达,并可以作为上皮源性肿瘤的微转移标记物。通过对Bmp4、Tff2、Krt19等基因表达的检测,有助于我们了解BE及EAC的病理生理的机制。本研究着重通过人体BE组织标本及动物模型食管病变标本,对胆汁酸在BE发病机制中的作用进行体内实验研究。为进一步研究胆汁酸及其受体与BE的发生发展提供依据。材料和方法：1.材料1.1人体BE组织标本来源于山东省千佛山医院2010～2014门诊及住院患者经内镜医师及病理科医师进行病理确诊的BE病人20例,取得患者同意,采取患者BE病变标本组织及周围正常食管粘膜作对照。BE标本采取自胃食管交界处开始向上每个厘米均采取相应四个象限标本。1.2 Wister大鼠的分组与处理2月大Wister雄性大鼠(重约250g-280g)购于山东大学试验动物中心,分为手术组和非手术组。在手术组分设三组,A组包含30只大鼠,通过手术行全胃切除,十二指肠近端封闭,并行食管-十二指肠端侧吻合术,形成单纯胆汁酸反流组。B组包含30只大鼠,行食管胃交界处纵行切开并与十二指肠行侧侧吻合术,手术造成胃酸及胆汁酸混合性反流。C组为对照组,10只大鼠行单纯开腹关腹手术。非手术组大鼠也分设三组,D组包含30只大鼠,用含胆汁酸(0.3% DCA, pH 7.0)的饮用水进行饲喂。E组30只大鼠用含胃蛋白酶(0.5mg/L)的酸性饮用水(HCl0. Olmol/L, pH2.0)进行饲喂。F组为对照组,10只大鼠用正常饲料及清洁水饲喂。所有大鼠均饲养6个月,6个月后存活的大鼠处死后进行进一步研究。2.方法2.1人体BE标本处理。2.1.1免疫组化法检测FXR表达。Western blot检测FXR蛋白表达。2.1.2应用免疫组化染色检测CDX-2及Muc2表达。2.1.3应用Real-Time PCR法检测人体BE组织及正常食管粘膜组织COX-2 mRNA水平。2.1.4对FXR与CDX-2、COX-2表达相关性进行分析。2.2模型动物食管标本处理。2.2.1组织学检测大鼠麻醉后处死,取出食管组织,沿食管长轴纵行剪开食管,观察食管大体病变情况,并将食管组织纵行均分成三份,分别进行病理学及生化研究。食管HE染色切片经两位有经验的病理医师分别进行病理诊断,食管病变分为角化过度、上皮增生、食管炎症、食管溃疡、Barrett's食管、及食管腺癌。2.2.2免疫组化法检测食管FXR表达,免疫组化染色检测食管组织CDX-2及Muc2表达。2.2.3 ELISA法检测动物血浆中IL-6及TNF-a水平。2.2.4 Semi-quantitative RT-PCR法检测Cdx2、Muc2、Bmp4, Kit19以及Tff2基因的表达。结果：1.人体BE组织实验结果1.1 FXR在人体BE组织中表达明显升高。本实验中共包含20例BE患者,免疫组化法染色显示BE组织中FXR染色阳性,其中以核染色为主,周边组织亦有染色,正常食管粘膜组织FXR阳性染色少见。West blot检测显示FXR在BE组织中高表达,在正常食管粘膜组织中无表达或弱表达,具有显著性差异。1.2免疫组化染色显示,人体BE组织中CDX-2、Muc2表达弱阳性至强阳性,在正常食管粘膜中几乎不表达,分析发现CDX-2、Muc2在正常食管粘膜组织中的表达显著低于BE组织中的表达。较正常食管粘膜BE组织中CDX-2 mRNA水平明显升高,具有显著性差异。1.3 Real-Time PCR检查显示BE组织中COX-2 mRNA水平较正常食管粘膜组织明显升高。1.4对FXR表达水平及CDX-2、COX-2表达水平分别进行相关性分析,显示FXR表达与CDX-2成表达成正相关,与COX-2表达成正相关,CDX-2表达与COX-2表达成正相关。2.动物模型试验结果2.1 手术模型组中,与对照组相比两种反流手术均导致食管炎症、BE及食管腺癌的发生,结果具有统计学意义。但两组反流性手术之间发生食管炎症、BE及食管腺癌的几率并无统计学意义,与单纯胆汁反流相比混合反流并未增加BE发生率(x2=0.0565,p0.05)。但是在非手术模型组中,与对照组相比喂食胆汁酸组与喂食胃酸及胃蛋白酶组均可导致食管炎症及BE发生,而且两组之间导致BE(x2=4.83,p0.05)发生的几率具有明显差异。2.2同人体组织一样,FXR、CDX-2及Muc2在诊断为BE的大鼠食管组织中高表达,在对照组中低表达或无表达。2.3在手术模型组中,单纯胆汁酸反流导致食管炎症发生率为80%,混合反流发生率为90.5%,两者相比无统计学意义(x2=0.04,p0.05)。但是在非手术模型组中胆汁酸饲喂较加入胃蛋白酶的酸性液体饲喂导致食管炎症的发生率有明显不同(x2=8.96,p0.01)。在两种返流手术组及胆汁酸饲喂组中检测到IL-6和TNF-a的水平明显升高,结果具有统计学意义。2.4通过Semi-quantitative RT-PCR法测得两种反流手术组及胆汁酸饲喂组中CDX-2和Muc2表达水平升高,且具有统计学意义,并与免疫组化结果一致。作为细胞分化增生的标记Bmp4, Kit 19及Tff2表达水平在两种反流手术组及胆汁酸饲喂组中也升高,结果具有显著性差异(p0.05)。结论：FXR在BE中表达较正常食管粘膜组织明显升高。BE组织中CDX-2、Muc2和COX-2表达明显升高,并与FXR表达正相关,通过成功建立起两种动物模型并研究证实胆汁酸而非胃酸是BE发生中的主要因素,胆汁酸及其受体导致BE的发生与其引发食管的炎性反应有关,引起炎性反应介质IL-6和TNF-a高表达,并导致相应的分化增生基因高表达,最终导致BE的发生,抑制胆汁酸有可能成为预防治疗BE的一种手段。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.1

【共引文献】