MicroRNA-582-5p靶向抑制Rab27a介导结肠癌细胞与分子机制研究

发布时间：2018-03-03 09:29

本文选题：miR-582-5p　切入点：Rab27a　出处：《昆明医科大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究目的结肠癌已成为一种高发病与高死亡率率癌症,然其发生的内在分子机制仍不清楚且没有统一的认识。microRNA已经被大量报道在调控结肠癌细胞功能的过程中扮演着重要角色,其中的一个重要成员miR-582-5p已被报道在结肠癌组织中受到抑制,表达处于较低水平,提示其可能参与了结肠癌的调控。本文旨在研究miR-582-5p对于介导结肠癌的作用研究以及探索其内在机制。首先,研究miR-582-5p在25例患者的结肠癌组织以及人结肠癌细胞系(SW480、HCT-116、 LoVo、HCT8和SW620)的表达水平,分析miR-582-5p的表达变化对于结肠癌细胞的增殖、凋亡、侵袭以及细胞周期的影响,并研究miR-582-5p对结肠癌发生发展的调控功能。其次,研究miR-582-5p靶向调控的转录因子Rab27a对于结肠癌细胞系增殖、侵袭以及细胞周期的影响。最后,检测miR-582-5p对于Rab27a相关信号通路的调控,以此来寻找miR-582-5p靶向调控Rab27a介导结肠癌的分子机制。方法1.利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-582-5p在结肠癌组织、癌旁组织以及结肠癌细胞系的表达变化。使用miR-582-5p mimic对进行细胞进行瞬时转染,使:niR-582-5p过表达。使用Western blot以及细胞活力检测实验(MTT)、细胞周期分析、凋亡实验和细胞侵袭实验从分子和细胞水平检测miR-582-5p对于结肠癌细胞的影响。2.利用生物信息学和荧光素酶报告实验筛选并确定miR-582-5p调控结肠癌的直接靶基因。3.构建Rab27a过表达质粒(Rab27a),在过表达miR-582-5p的基础上转染Rab27a过表达载体。通过qRT-PCR、蛋白免疫印迹、MTT实验、细胞周期分析、细胞凋亡实验和侵袭实验验证miR-582-5p靶向调控的转录因子Rab27a对于结肠癌的调控效应。4.构建FAK的siRNA慢病毒表达载体以及使用Integrin抑制剂Cilengitide(CIL),并借助qRT-PCR和蛋白印迹实验在结肠癌细胞中探索miR-582-5p对Rab27a的调控与integrin信号转导途径的关系。使用MTT实验、细胞周期分析、细胞凋亡实验和侵袭实验探索integrin信号转导途径对于miR-582-5p通过负调控Rab27a介导的结肠癌细胞的活力、侵袭、凋亡和细胞周期的影响。在结肠癌的临床组织中检测Rab27a、Integrin-β1、FAK及p-FAK (Y397)的表达变化。结果1.人正常组织中,miR-582-5p在结肠、胃和小肠等胃肠道系统,肝脏和脾脏等消化组织中表达较低。进一步的检测发现,25例结肠癌患者的组织中有19例组织中的miR-582-5p下调明显。并且miR-582-5p在结直肠癌细胞系和结直肠癌组织中表达与正常细胞对照组相比下调(HCT8、HCT-116、LoVo、SW480和SW620),而癌旁组织没有变化。miR-582-5p通过抑制细胞周期的G1向S期发展从而的制约结直肠癌细胞增殖：(1)MTT细胞活性检测结果表明过表达miR-582-5p抑制结肠癌细胞增殖；(2)过表达miR-582-5p的SW480和HCT-116细胞G1期的细胞数显著增加,但在S期的细胞数显著降低。过表达miR-582-5p增加SW480和HCT-116细胞的凋亡；(3) Rb/E2F1的Western blot检测结果为,Rb在癌细胞系中表达较低,而E2F1在癌细胞系中表达较高,过表达：miR-582-5p后,上调Rb的表达,下调E2F1的表达。Transwell细胞侵袭实验结果发现,过表达miR-582-5P抑制了结肠癌细胞侵袭能力。结肠癌细胞系中PARP-1被过表达miR-582-5p下调,PARP-1 cleaved form被过表达miR-582-5p上调。并且过表达miR-582-5p可抑制mTOR、Akt、pAk、Erk1/2以及pErk1/2等相关信号分子的表达。2在结肠癌细胞系中,qRT-PCR和Western blot的检测均表明过表达miR-582-5p显著抑制Rab27a的表达。在结肠癌患者结肠组织的检测发现,19例miR-582-5p下调的组织中Rab27a的上调明显强于6例miR-582-5p未下调的患者组织。生物信息学预测与荧光素酶报告实验结果发现,在miR-582-5p调节结肠癌的病理过程中Rab27a是其直接的调控靶基因之一。3成功构建Rab27a稳定的过表达载体,在过表达miR-582-5p的基础上,继续转染Rab27a过表达载体。MTT实验、细胞周期实验与Transwell细胞侵袭实验结果表明,Rab27a过表达逆转了miR-582-5p对于癌细胞增殖与侵袭的抑制效应。而过表达Rab27a亦逆转过表达miR-582-5p对于E2F1、PARP-1、Erkl/2、p-Erkl/2以及PI3K/Akt途径相关蛋白抑制效应；过表达miR-582-5p导致Rb和PARP-1 cleaved form的上调也被Rab27a的过表达逆转。4过表达：miR-582-5p后继续过表达Rab27a,检测Integrin信号转导途径关键蛋白Integrin-β1、FAK、p-FAK(Y397)以及信号下游的Wnt经典通路与Ras/raf/ERK信号通路关键蛋白。结果发现,过表达Rab27a可逆转miR-582-5p对于Integrin-β1、 FAK、p-FAK (Y397)以及Wnt经典通路与Ras/raf/MEK/ERK主要蛋白的抑制效果。使用Integrin信号转导途径的抑制剂Cilengitide (CIL)后,发现CIL可以下调Rab27a、BAX、BAK、IGF-Ⅱ、ILK以及cyclin D1并且下调PI3K/Akt信号通路、Wnt信号通路和Ras/raf/MEK/ERK信号途径的关键蛋白。成功构建integrin信号转导途径中的FAK的siRNA慢病毒表达载体,并感染结肠癌细胞系,得到与Cilengitide相似的结果。另外我们获得的25例患者组织中有19例miR-582-5p是下调(miR-582-5p-D)的,而6例组织miR-582-5p并无下调(miR-582-5p-ND),而对组织进行相关蛋白检测结果显示,结肠癌组织中Rab27a、Integrin-β1、FAK以及p-FAK (Y397)的表达有不同程度上调,miR-582-5p-D的组织中Rab27a、 Integrin-β1、FAK、p-FAK (Y397)上调幅度比miR-582-5p-ND更显著。结论在结肠癌组织和细胞系中,miR-582-5p表达均下调,而且过表达miR-582-5p能够通过靶向抑制Rab27a从而抑制结肠癌细胞生长细胞、从S期进入G1期的进程和细胞侵袭能力。并且FAK介导的Integrin信号转导途径可能是：miR-582-5p靶向Rab27a抑制癌细胞行为的主要调控因素。本研究为患者治疗结肠癌等肿瘤疾病提供一种潜在的治疗策略。
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【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.35

【参考文献】