抑癌蛋白PTEN的去泛素化酶鉴定及蛋白稳定性调控研究

发布时间：2018-03-03 16:00

本文选题：PTEN　切入点：OTUD3　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：PTEN是1997年在人类10号染色体上首次发现并克隆到的一个抑癌基因,通过20多年的研究发现PTEN在肿瘤的发生发展中起着至关重要的抑制作用。PTEN基因的生殖突变与体细胞突变与多种肿瘤的发生发展密切相关。作为一个抑癌基因PTEN在多种肿瘤中(例如子宫内膜癌,恶性胶质瘤,前列腺癌,乳腺癌,结肠癌以及肺癌)存在杂合缺失或者突变。在肿瘤易感性疾病例如Cowden或者Bannayan-Zonana综合症中也常发现PTEN基因的遗传突变。PTEN基因杂合缺失小鼠自发形成多种肿瘤,而纯合缺失小鼠死于胚胎期的9.5天。PTEN具有脂质和蛋白双重磷酸酶活性,它利用脂质磷酸酶活性将细胞质中的磷脂酰肌醇3,4,5三磷酸去磷酸化生成磷脂酰肌醇4,5二磷酸,从而抑制PI3K-Akt通路。同时PTEN也可以利用其非磷酸化酶功能在核内以不依赖PI3K-Akt通路的方式来发挥功能。PTEN蛋白剂量水平的精细变化就与肿瘤的发生发展密切相关。与传统的抑癌因子不同,PTEN的功能发挥是连续性的,也就是说PTEN的抑癌功能并不依赖基因拷贝数的改变而出现跳跃式变化。研究发现当小鼠体内PTEN水平维持在80%时,乳腺癌的发生率就高达40%,因此PTEN蛋白的稳定性调控至关重要。既然PTEN的蛋白水平的精细变化就与肿瘤的发生发展密切相关,那么机体一定存在一套严格的监管系统来维持PTEN的蛋白稳定性。与抑癌蛋白p53不同,p53在细胞内的蛋白水平低,半衰期短,而PTEN则具有相对较长的半衰期和较高的内源表达水平。那么一个重要科学问题就是在生物体内PTEN的强稳定性如何被维持呢?蛋白质的翻译后修饰是维持蛋白稳定性的主要途径。其中泛素-蛋白酶体途径是生物体内最主要的蛋白质水平调控途径,泛素连接酶与去泛素化酶共同调控蛋白稳定性的平衡。目前报道的PTEN泛素连接酶共有5个,Nedd4-1,WWP2,XIAP,CHIP和TRIM27。许多蛋白的泛素化修饰都可以被去泛素化酶(deubiquitinase,DUB)所逆转。人类基因组中大约有90个DUB分子。然而,对PTEN的去泛素化修饰还知之甚少。2008年Nature杂志报道位于细胞核的HAUSP可以去除PTEN的单泛素化修饰从而介导PTEN从细胞核转移到细胞质中。但是HAUSP对PTEN的蛋白稳定性却没有影响。因此在我们的研究工作开展时,能够特异去除PTEN的多聚泛素化维持其蛋白稳定性的DUB分子仍未被鉴定到。本课题的研究目的就是鉴定能够去除PTEN多聚泛素化促进PTEN稳定的DUB分子,同时研究其生理病理功能。针对鉴定能促进PTEN稳定的DUB分子这一科学问题,我们通过对全部人源DUB家族成员进行无偏向性筛选,发现OTU亚家族中的OTUD3(OTU domain-containing protein 3)分子可以显著地上调PTEN的蛋白水平。OTUD3定位于人类染色体1p36.13,是一个迄今为止研究极少的基因。通过我们的研究目前获得的主要数据有:(1)OTUD3作为PTEN的去泛素化酶调控PTEN的蛋白稳定性。OTUD3主要定位于细胞质中,N端的OTU结构域直接参与PTEN的C2结构域的结合,通过去除PTEN的多聚泛素化修饰、拮抗PTEN的泛素蛋白酶体降解,从而稳定PTEN的蛋白水平。敲低细胞内源OTUD3的表达,PTEN的蛋白稳定性显著下降,Akt通路被过度激活;在细胞中过表达野生型OTUD3,PTEN的半衰期延长,PI3K-Akt通路受到抑制。(2)OTUD3的功能。首先,裸鼠成瘤实验表明在乳腺癌细胞系中过表达野生型OTUD3而非酶活突变型C76A可以抑制肿瘤的形成。相反,在乳腺癌细胞系中敲低内源OTUD3的表达可以促进肿瘤细胞的转移。而在正常乳腺上皮细胞中敲低内源OTUD3的表达会使细胞发生转化,在裸鼠皮下注射该细胞可形成肿瘤。其次,在结肠癌细胞系HCT116、肺癌细胞系Hep G2以及子宫颈癌细胞系He La中敲低内源OTUD3的表达,会促进肿瘤的形成并且会促进肿瘤的肝或者肺转移,这说明OTUD3的抑癌功能并不仅仅局限于乳腺癌。最后,我们成功构建了OTUD3的转基因小鼠模型以及基因敲除小鼠模型。结果发现在OTUD3转基因小鼠的多种组织器官以及MEF细胞中PTEN都呈高表达,PTEN的稳定性增强,泛素化水平显著降低,Akt通路受到抑制,而基因敲除小鼠的表型与之相反。MMTV-Py MT转基因小鼠可以自发形成乳腺癌,是常用于乳腺癌研究的小鼠模型,为了在体内研究OTUD3的抑癌功能,我们将OTUD3转基因小鼠与MMTV-Py MT转基因小鼠交配。结果显示OTUD3转基因小鼠对MMTV-Py MT诱导的乳腺癌发生表现出显著的抑制效应。这从遗传学上充分证明OTUD3是PTEN的一个重要的稳定调控因子,在体内OTUD3发挥着重要的抑癌功能。(3)OTUD3与乳腺癌的关系。我们通过大规模临床乳腺癌病人样本检测发现,与癌旁组织相比,OTUD3在乳腺癌组织(PTEN基因的突变率低)中低表达,并且PTEN的蛋白水平与OTUD3的表达呈正相关性。且OTUD3的表达与病人的预后有明显相关性。OTUD3表达高,病人出现淋巴结转移的概率越小,生存期越长,预后越好。同时在乳腺癌中OTUD3和PTEN存在基因突变,OTUD3的突变体丧失了对PTEN的去泛素化修饰能力,在正常乳腺上皮细胞中过表达OTUD3-E86K突变体也会促进肿瘤的形成,说明E86K突变将OTUD3从一个抑癌基因转变为癌基因。这与抑癌因子PTEN和p53相似。而PTEN的突变体却丧失了与OTUD3的相互作用能力,从而失去了OTUD3的保护,结果导致PTEN蛋白的不稳定。我们的研究表明OTUD3分子是PTEN重要的正调控因子,OTUD3-PTEN通路在肿瘤的抑制过程中发挥着重要作用。总之,我们的研究回答了PTEN领域中一个长期没有解决的重大问题,弥补了通过拮抗泛素化降解从而促进对PTEN稳定性调控这一机制长期未被解决的缺憾。OTUD3基因定位于人类染色体1p36.13,该区在乳腺癌中常发生缺失,同时该区与肿瘤的转移,预后差以及易复发等特性密切相关。通过研究我们发现OTUD3也是位于这一区域的一个重要的候选抑癌基因。冠状病毒跟呼吸道、肠、肝脏、中枢神经系统疾病密切相关。然而直到二十世纪60年代,冠状病毒都没有被发现是引起人类疾病的病原体,直到2003SARS病毒在全世界的大爆发和蔓延,引起人类的大恐慌,冠状病毒才得到全球的关注。SARS冠状病毒在全球32个国家蔓延感染了8000多人,致死率高达10%。SARS疫情控制以后,科学家们加大了对冠状病毒的研究发现了另一支冠状病毒NL63。研究表明有7%的住院病人感染NL63,感染的小孩和大人常出现上呼吸道以及下呼吸道感染、支气管炎、以及结膜炎。但是很遗憾到目前为止还没有有效的抗病毒药物来治疗冠状病毒感染。冠状病毒感染宿主细胞后,病毒RNA编码两类较大的融合蛋白pp1a和pp1ab,这些融合蛋白被病毒半胱氨酸蛋白酶(PLPs/PLpro/3CLpro)切割成成熟的非结构性蛋白。NL63病毒编码两类半胱氨酸蛋白酶PLP1和PLP2来切割病毒复制酶,病毒复制酶常常在病毒感染24小时后就能被检测到。前期研究表明PLP2蛋白具有去泛素化酶活性,而且能抑制宿主细胞Ⅰ型干扰素的表达。Ⅰ型干扰素能够很好的抑制冠状病毒的复制增殖,而且IFN-β的效果比IFN-α好。然而临床研究表明冠状病毒感染只会激发宿主细胞产生极低浓度的Ⅰ型干扰素,从而宿主细胞只能产生微弱的免疫应答导致导致病毒疯狂复制。但是这其中具体的调控机制到目前还不是很清楚。自1979年P53基因被首次克隆鉴定起,科学家们就投入了大量的精力去探索P53基因的功能,并发现该基因在维持基因组的稳定性以及细胞周期和细胞凋亡调控中发挥着重要作用。但是,P53基因的功能“多样性”使得它总能给我们带来新的惊喜。最近的研究表明p53是Ⅰ型干扰素(IFNα/β)通路直接的靶基因,在病毒感染时一些细胞因子可以激活p53的表达。这表明p53在抗病毒先天免疫中发挥着功能。由于病毒感染可以激活p53通路,因此p53分子被认为是宿主细胞抵抗病毒感染的新成员。事实上,p53在介导感染细胞的凋亡以及诱发Ⅰ型干扰素合成中发挥着重要作用。体内体外实验表明p53可以抑制很多病毒的复制增殖。p53在抗病毒先天免疫中的功能能够很好的解释为什么P53基因在寿命很短的简单原生动物中就存在,而在这些原始生命中P53基因根本不需要承担抑制组织细胞生长失控的责任(例如肿瘤的发生),以及为什么p53常是病毒蛋白的作用靶点。但是我们不得不承认p53在抗病毒免疫调控中的研究还非常有限,p53在其中的具体调控机理还不是非常明确。P53在免疫调控领域的研究还有很长的路要走。我们的研究发现NL63编码的木瓜样蛋白酶PLP2通过对MDM2的去泛素化修饰来稳定其蛋白稳定性,进而促进p53的降解以及抑制其转录因子活性,从而抑制病毒感染所引起的IFN-β的转录激活以及细胞凋亡,最后抵抗宿主细胞的免疫应答反应导致病毒在宿主细胞体内大量增殖。同时我们发现IRF7是p53直接的靶基因,在免疫应答过程中p53转录激活IRF7的表达。我们的工作深入研究了p53在宿主细胞抵抗病毒感染的先天免疫调控中的功能及其作用机制,并且探索了病毒蛋白PLP2在抵抗宿主抗病毒天然免疫反应中的作用机制。本研究不仅具有重要的科学意义,而且将为病毒的临床治疗与预防提供重要的参考。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.5

【共引文献】