miR-21对胰腺导管腺癌细胞增殖、凋亡和侵袭的影响及相关机制的研究

发布时间：2018-03-05 03:04

本文选题：胰腺导管腺癌　切入点：miR-21　出处：《武汉大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景：胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)恶性程度高、进展快、诊断难、治疗效果及预后效果差等特点,严重威胁人类的健康。PDAC位于癌症死亡的原因第4名,5年期生存率仅为3%～5%,中位生存期不超过6月。如何有效的干预PDAC的发生和治疗PDAC患者,提高其生存率成为目前重大紧迫的问题。因此寻找PDAC有效的治疗靶点,阐明其发病机制具有重要的意义。越来越多的研究证实,除PDAC自身蛋白编码基因突变外,microRNA(miRNA)的表达失调也会影响PDAC的发生发展。miRNA是近年来发现的广泛存在动植物体内的非编码单链RNA,长约18-26个碱基。miRNA与靶基因3’UTR结合,通过降解靶基因,并且miRNA可以通过抑制基因翻译对各种生物活动发挥负向调控作用。大量研究报道证实miRNA可以调控细胞的增殖、胚胎早期发育,细胞分化、细胞凋亡,细胞的免疫调节等。近年的研究还发现,miRNA还扮演抑癌基因和促癌基因的角色,不同类型肿瘤组织中存在其特异的miRNA表达谱,许多miRNA与肿瘤发生、发展、诊断、治疗及预后都密切相关。目前研究发现包括miR-101、miR-122、miR-13a、 miR-195、miR-21、miR-221、miR-301等在内的众多niRNA在胰腺癌中异常表达,并在胰腺癌的发生发展中发挥重要作用。这些miRNA的异常表达能通过对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学行为的影响进而影响PDAC的发生和发展。然而,对于这些异常表达的niRNA是如何参与PDAC的发生和发展的分子机制却有待于进一步的研究,探索PDAC中表达异常的miRNA及其功能和作用机制,寻找PDAC新的特异性标记分子,可为PDAC的诊断、治疗和预后判断提供新的理论依据。目的：本研究旨在分析miR-21在胰腺导管腺癌组织中的表达水平,并统计分析miR-21及其潜在靶基因表达量与胰腺导管腺癌患者临床病理特征的关系,在此基础上再以获得性与缺失性功能实验确定miR-21在胰腺导管腺癌细胞中的生物学功能,分析和验证其发挥功能的直接靶基因,探求其在胰腺导管腺癌发生发展中可能的分子机制。方法：利用real time-PCR法检测miR-21在胰腺导管腺癌组织及细胞中的表达情况；利用real time-PCR和western blot法检测细胞凋亡、增殖、分化和转移等生物学行为密切相关的调控因子PTEN、Bcl-2和c-Myc的mRNA和蛋白表达情况；统计分析miR-21、PTEN、Bcl-2和c-Myc表达量与胰腺导管腺癌患者临床病理特征之间的相关性；通过体外转染pre-miR-21和miR-21 inhibitor,以MTT、克隆形成、流式细胞术、划痕实验、transwell小室等实验方式检测miR-21对胰腺导管腺癌细胞生物学行为的影响；通过双荧光素酶报告基因系统、过表达实验、western blot等方法鉴定miR-21的直接功能靶基因,并检测细胞周期、凋亡、侵袭相关分子在miR-21和PTEN过表达细胞中的变化,进一步探讨miR-21参与胰腺导管腺癌细胞生物学行为调控的分子机制。结果：1. 分别检测了38例胰腺导管腺癌组织及配对的癌旁组织、3株胰腺癌细胞系和1株正常胰腺导管上皮细胞中miR-21的表达水平,发现miR-21在胰腺导管腺癌组织和胰腺导管腺癌细胞中的表达水平明显上升,差异具有显著性。2.分析miR-21与胰腺导管腺癌临床病理特征相关性,发现miR-21表达水平与患者年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤大小无关,与肿瘤的分级、TNM分期及淋巴转移密切相关。提示miR-21可作为一个判断胰腺导管腺癌患者预后的标记分子。3. Real-time PCR和western-blot分析PTEN、Bcl-2、c-Myc在胰腺导管腺癌组织中的表达水平,结果显示,Bcl-2、c-Myc在癌组织中表达上调,差异具有统计学意义,PTEN表达显著下调,差异具有统计学意义。与胰腺导管腺癌临床病理特征相关性分析发现,PTEN、Bcl-2和c-Myc与肿瘤患者年龄、性别、肿瘤位置等病理因素无关,与肿瘤的病理分级、临床分期和淋巴转移密切相关。提示PTEN、Bcl-2、c-Myc的表达能反映胰腺癌的生物学行为,可协同作为胰腺导管腺癌诊断标记分子。4.miR-21表达与PTEN表达呈负相关,与c-Myc表达呈正相关,与Bcl-2表达趋势一致,但无显著相关性,提示PTEN可能为miR-21直接调控的功能靶基因。5.miR-21体外功能研究结果显示：MTT、克隆形成实验证实miR-21促进了胰腺导管腺癌细胞的体外增殖能力；流式细胞凋亡检测发现miR-21能抑制胰腺导管腺癌细胞的凋亡；流式细胞周期检测发现miR-21能促使癌细胞由G期向S期转化；划痕实验证实miR-21过表达促进了癌细胞的迁移；transwell实验提示miR-21能显著增强癌细胞的侵袭能力。6.细胞表型变化与细胞调控因子检测相结合,推测PTEN、Bcl-2和c-Myc为miR-21候选靶基因,Western blot分析表明胰腺导管腺癌细胞中调控miR-21的表达能显著影响PTEN、Bcl-2和c-Myc蛋白的表达。7.通过构建PTEN 3'-UTR野生型和突变型的荧光素酶报告载体,共转染PTEN3'-UTR野生型和突变型与pre-miR-21于肿瘤细胞后,野生型PTEN 3'-UTR和miR-21共同转染肿瘤细胞后,导致降低了荧光素酶活性,突变型转染组荧光素酶活性无明显变化,表明miR-21的过表达可以直接作用于PTEN 3'-UTR的靶序列,下调靶基因PTEN的表达。8.miR-21过表达显著上调PTEN/AKT信号通路中关键分子pAKT、PFOXO3a、 Cyclin1、Cdk2、MMP2蛋白的表达,下调P21、Bax的表达。表明miR-21通过PTEN/AKT信号通路干扰其下游众多信号分子的表达进而参与细胞凋亡、周期调控、侵袭和转移等细胞生物学行为的调控。结论：1.miR-21在胰腺导管腺癌组织中的表达明显上调,提示miR-21表达增高,和胰腺导管腺癌病理过程呈正相关。胰腺导管腺癌组织中miR-21的表达水平与胰腺癌患者的病理参数密切相关,提示miR-21的过表达可作为诊断胰腺导管腺癌及其患者预后的潜在预测指标。2.Bcl-2和c-Myc在胰腺导管腺癌组织中的表达明显上调,PTEN在胰腺导管腺癌组织中的表达明显下降,并均与胰腺癌患者的病理参数相关,暗示PTEN、Bcl-2和c-Myc参与胰腺导管腺癌的调控,可作为潜在分子靶标用于胰腺癌的诊断。3.miR-21促进胰腺导管腺癌细胞增殖、克隆形成、侵袭和迁移,抑制细胞凋亡。4. PTEN被鉴定为miR-21的直接功能靶基因。Bcl-2、c-Myc为miR-21的间接功能靶标。5.miR-21通过PTEN/AKT信号通路间接调节CyclinD1、Bcl-2、c-Myc、MMP2等蛋白的表达来参与细胞凋亡、周期调控、侵袭和转移等细胞生物学行为的调控。
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【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.9

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