泛素连接酶Cbl-b对皮肤黑素瘤增殖、凋亡、侵袭能力的影响及其作用机制初步研究

发布时间：2018-03-05 05:09

本文选题：泛素连接酶　切入点：黑素瘤　出处：《北京协和医学院》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分泛素连接酶Cbl-b在皮肤黑素瘤组织和细胞系中的表达及意义目的:探讨泛素连接酶Cbl-b在黑素瘤细胞系A375、M14、MV3和黑素瘤组织中表达情况,并分析其与黑素瘤临床病理特征的相关性。方法:通过免疫组织化学方法检测Cbl-b蛋白在69例皮肤黑素瘤组织及30例色素痣表达,并分析其与皮肤黑素瘤临床病理特征相关性。QPCR、细胞免疫荧光、Western blot检测Cbl-b在黑素瘤细胞系A375、M14、MV3及黑素细胞中mRNA及蛋白水平。结果:免疫组化发现Cbl-b在69例皮肤黑素瘤和30例色素痣中分别有52例(75.36%)和4例阳性(13.33%),两组差异有统计学意义(x2=32.745,p0.01)。Cbl-b表达与皮肤黑素瘤相关预后因素,如肿瘤进展、Clark分级和Breslow厚度呈显著正相关(rs=0.569;rs=0.654;rs=0.727,p值均0.01)。溃疡组Cbl-b表达显著高于非溃疡组(p0.01)。QPCR示Cbl-b在黑素细胞及黑素瘤细胞株A375、M14、MV3mRNA表达差异有统计学意义(F=176.537,p0.01)。细胞免疫荧光、免疫印迹法检测发现皮肤黑素瘤细胞株Cbl-b表达均高于正常黑素细胞,以A375表达水平最高。结论:皮肤黑素瘤和其细胞株均高表达Cbl-b蛋白,说明Cbl-b可能在皮肤黑素瘤发病过程中起正性调控作用。第二部分泛素连接酶Cbl-b基因shRNA慢病毒载体构建及其对黑素瘤A375细胞生物学行为影响目的:构建泛素连接酶Cbl-b基因shRNA慢病毒载体,并研究其对黑素瘤A375细胞生物学行为影响。方法:设计并合成3条沉默Cbl-b基因的特异性shRNA,构建慢病毒载体转染黑素瘤A375细胞。应用QPCR和Western blot筛选沉默效率最高重组慢病毒载体。CCK8法检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期,Transwell法检测细胞侵袭能力。结果:成功构建3条Cbl-b shRNA慢病毒载体。QPCR和Western blot发现CBLB-shRNA-3沉默效率最高。CCK8检测表明CBLB-shRNA-3组细胞增殖能力在72h和96h较阴性对照组、空白对照组明显减低(p0.01)。流式细胞仪检测示CBLB-shRNA-3组凋亡率(22.73±6.58)%明显高于阴性对照组(6.08±1.35)%和空白对照组(6.34±1.07)%(p0.01)。CBLB-shRNA-3组G1期细胞比例明显高于阴性对照组、空白对照组(p0.01),而S期细胞比例明显低于阴性对照组、空白对照组(p0.01),表明细胞发生了 G1期阻滞。Transwell检测结果示阴性对照组、空白对照组和CBLB-shRNA-3组72h时穿膜细胞数分别为(76.60±1.82)个,(73.20±3.83)个,(19.60±1.14)个,CBLB-shRNA-3组明显低于阴性对照组、空白对照组(p0.01)。结论:成功构建高效沉默Cbl-b基因的CBLB-shRNA-3 shRNA重组慢病毒载体,沉默Cbl-b可抑制黑素瘤A375细胞增殖、细胞周期和侵袭能力,促进细胞凋亡。第三部分应用蛋白质组学分析Cbl-b在黑素瘤细胞A375中相关蛋白目的:分析Cbl-b在黑素瘤细胞A375中相关蛋白。方法:使用非标记定量蛋白质组学技术鉴定Cbl-b shRNA组A375细胞株及阴性对照A375细胞株差异蛋白表达。采用生物信息学方法对差异蛋白进行分析。利用Western blot验证部分差异蛋白(EphA2、GSK3 β)表达和Cbl-b shRNA干扰后p-AKT表达。结果:本次试验共鉴定3449种蛋白,其中差异表达蛋白质74个,Cbl-b shRNA组相对阴性对照组上调蛋白52个,下调蛋白22个。聚类分析发现差异蛋白可有效区分样本。GO富集分析发现差异蛋白主要生物学过程包括:整合素介导的细胞粘附、单一生物代谢过程、整合素介导的细胞粘附调节、调节蛋白质靶向线粒体、核苷酸代谢进程;主要分子功能包括:DNA结合、2,2铁硫簇合物结合、信号受体活性、钙粘蛋白结合。KEGG通路富集分析发现通路主要包括:叶酸生物合成、轴突导向、细胞外基质受体相互作用、黏合连接、Wnt信号通路、Hippo信号通路、叶酸拮抗剂抵抗、氧化磷酸化、PI3K-Akt信号通路等。Western blot验证差异蛋白EphA2、GSK3 β表达与蛋白质组学结果一致。Cbl-b shRNA干扰A375细胞后p-AKT水平降低。结论:Cbl-b可能通过多种生物学通路参与黑素瘤发病。EphA2/PI3K/AKT信号通路可能是Cbl-b参与黑素瘤形成的重要机制之一。
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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R739.5

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