PAX9对食管鳞状细胞癌临床预后及放射敏感性的价值研究

发布时间：2018-03-05 08:12

本文选题：食管鳞状细胞癌　切入点：成对盒基因9　出处：《山东大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：前言：食管癌是世界上最为常见的恶性肿瘤之一,具有较高的发病率和死亡率。根据2012年的统计,全球大约有455800新发病例和400200死亡病例。食管癌在不同的地区,发病率差异较大。东亚、非洲东部和南部以及法国的北部是世界上的高发地区。作为食管癌的高发国家,中国的特点是90%以上的病理类型为鳞状细胞癌。而在美国,鳞癌仅占食管癌总数的26%。目前比较肯定、有效的治疗方法包括手术、放疗和化疗,虽然我们在临床诊断和治疗方法上取得了重大的进展,但是食管癌预后仍然较差,5年总生存率不超过15%。对食管癌特征进行评估的传统方法,主要依靠视觉信息的综合,包括肿瘤的体积、浸润深度、组织学类型等,以便进行病理分期。尽管这些参数能够在一定程度上将具有不同生物学特性的食管癌分为几个肿瘤亚型,然而我们在临床工作中发现,这样的分类无法准确区分肿瘤的生物学行为,不能为临床治疗方案的选择提供精确的依据。因此,亟待解决的问题是探寻食管癌有效的生物标志物,用以识别肿瘤独特的生物学特性,从而能够准确判断患者的预后,并改进治疗策略,进一步提高治愈率。一个成功的肿瘤标志物,或者能够鉴别良性肿瘤和恶性肿瘤,或者能够区别肿瘤的分化程度、病理分期等生物学状态,用以指导治疗方法或提供治疗靶点。目前针对肺癌、乳腺癌、结直肠癌在发病机制和靶向治疗方面的研究,已经取得了巨大的进展,但在食管癌,我们知之甚少。PAX9是成对盒基因家族中的一员,该家族目前已发现9种不同的基因,分别为1-9。它们主要是通过细胞增殖、迁移和凋亡抵抗方面调节基因表达,在胚胎发育和器官形成等几个方面发挥了十分重要的作用。PAX基因家族通常被认为是细胞系特异性的组织调节器,在其表达谱上完美地进行时间和空间上的调节；而目前被认为与肿瘤的进展过程密切相关。Muratovska Aleksandra的研究显示,在人类多种恶性肿瘤中可以检测到PAX2异常扩增,主要在乳腺癌、卵巢癌中高表达。PAX3是黑色素瘤细胞系生存所必需的的基因,同时也在乳腺癌中表达。PAX6主要在大脑恶性肿瘤以及乳腺癌中表达水平均较高。PAX2、PAX8在肾组织中均可见到表达。在肺泡横纹肌肉瘤、B淋巴细胞淋巴瘤和甲状腺恶性肿瘤中分别可见到PAX3、PAX5、PAX7和PAX8染色体易位。PAX5被认为是功能性肿瘤抑制基因,通过直接调节P53信号参与肝细胞肿瘤的发生、发展过程。PAX9位于人14号染色体q12-q13区,具有一个由128个氨基酸组成的DNA结合配对域,能够与DNA序列特异性结合。根据以前的文献报道,作为牙齿形态发育过程中的转录因子,其表达在牙齿间充质中,PAX9的杂合子基因突变可以导致牙齿发育不全,主要是磨牙缺失。最近10年的研究发现,PAX9在许多恶性肿瘤中出现异常表达,并与肿瘤的发生、进展密切相关。一项针对食管癌全基因组测序的大型实验显示,在食管鳞状细胞癌中PAX9的异常扩增较腺癌显著升高。因此,PAX9被推测是食管鳞状细胞癌的特异基因型,或许有望发展为精准医疗的治疗靶点。研究目的：本课题主要研究PAX9蛋白在可手术食管鳞状细胞癌患者肿瘤组织中的表达情况,分析其对临床预后的意义,并探讨PAX9对预测食管鳞癌放射敏感性的价值。研究方法：1.病例收集：纳入2008年1月1日-2009年12月31日在山东大学齐鲁医院接受根治性手术的食管鳞状细胞癌患者共229例。收集病例资料包括：患者的年龄、性别、饮酒史、吸烟史、病灶位置、组织学分级、病灶长度、T分期、N分期、pTNM分期、术后辅助治疗等临床特征及随访信息。2.收集患者术后的肿瘤组织样本,常规行固定、包埋后,制成3mm厚的病理组织切片。每位患者行HE及PAX9免疫组化双染色。设置阴性对照组和阳性对照组。3.应用Olympus IX71S1F-3倒置显微镜计数。仔细观察,从每张切片中至少选取5个视野,每高倍镜视野至少100个肿瘤细胞,根据半定量分析,分为PAX9阴性组(1-3分)和PAX9阳性组(4-8分)。4.应用SPSS 19.0统计软件,采用卡方检验,log-rank检验,K-M分析,COX比例风险回归模型等方法,对获得的数据进行统计学分析,P0.05认为有统计学意义。研究结果：1.实验共纳入229例食管鳞癌患者,中位年龄为60岁(范围为32-84岁)。其中,185例(80.8%)为男性,44例(19.2%)为女性。颈段7例,胸上段16例,胸中段130例、胸下段76例。肿瘤中位长度为4.17 cm(范围0.5-10.0)。按照组织学分级,高分化癌55例,中分化癌99例,低分化癌和未分化癌75例。处于T1、T2的患者88例(38.4%),处于T3、T4的患者141例(61.6%)。具有淋巴结转移的患者109例(47.6%)。参照第七版AJCC TNM分期,所有患者中,Ⅰ期26例,Ⅱ期101例,Ⅲ期102例。110例患者(48.0%)仅接受了手术治疗,53例患者(23.1%)术后进行了化疗,101例患者(44.1%)术后进行了放疗,还有35例患者(15.3%)接受了术后放化疗。随访期间,213例患者(93.0%)发生了肿瘤复发,182例患者(79.5%)死亡。5年无进展生存率和总体生存率分别为15.3%和31.4%,中位无进展生存期25.9月(范围1.0-81.4月)。中位生存期37.0月(范围1.7-83.2月)。2.生存指标：在PAX9阴性组,1年、3年、5年的DFS分别为72.2%、35.2%、5.6%,OS分别为86.1%、44.4%、23.1%。在PAX9阳性组,1年、3年、5年的DFS分别为76.9%、47.9%、24.0%,OS分别为90.9%、57.9%、38.8%。PAX9阴性组患者的MST为29.4月(范围1.7-73.1月),而PAX9阳性组的MST为42.0月(范围3.5-83.2月)。K-M曲线分析,两组患者无论是DFS还是OS均具有统计学差异。3.预后分析：单因素分析显示,PAX9低表达(P=0.001),肿瘤长度增加(P=0.027),肿瘤分化程度下降(P0.001),T分期增加(P0.001),淋巴结转移(P0.001)和病理分期靠后(P0.001)均与食管鳞癌DFS和OS降低相关。在多因素分析中,PAX9对食管鳞癌DFS的相对危险度为0.601(P=0.001), PAX9对食管鳞癌OS的相对危险度为0.662(P=0.007),都是独立预测因子。4.亚组分析：对于没有接受术后辅助治疗的食管鳞癌患者,PAX9阴性组和PAX9阳性组在DFS及OS方面无统计学差异。而接受术后辅助治疗的食管鳞癌患者,两组在DFS及OS方面有显著性统计学差异。在PAX9阳性的食管鳞癌患者中,相比单纯手术组,术后放疗组具有更高的5年DFS和OS。对于PAX9阴性食管鳞癌患者的5年DFS和OS,有无术后辅助治疗二者并无差异。结论：1.肿瘤组织中PAX9表达降低是食管鳞状细胞癌术后患者不良预后的独立因素。2.PAX9可能是食管鳞癌放射敏感性的预测因素,有助于指导临床实践,为患者制定更加合理的个体化的治疗方案,有望发展为精准医疗的治疗靶点。前言：我国是世界上食管癌高发国家,其特点是病理类型以鳞状细胞癌为主。食管癌的致病因素包括：化学病因,生物性病因,微量元素缺乏,维生素类缺乏,吸烟,嗜酒,过热食物,遗传因素等,但尚未完全明确。根据最新的统计结果,中国食管癌患者数量逐年增多。放射治疗的适应症越来越广泛,对于早期食管癌,根治性放疗取得了不劣于手术的疗效。对于失去手术指征的食管鳞状细胞癌,放射治疗是最佳治疗策略之一。但是,研究中发现,对食管鳞状细胞癌进行术前放疗或同步放化疗后,病理完全缓解率仅有29%左右,有效率在50%-60%,相当一部分患者肿瘤灶没有缩小甚至较治疗前增大,说明食管鳞癌在放射敏感性方面存在差异。而且,综合分析多项随机试验的结果表明,对于放射抵抗的食管癌患者,即使增加食管鳞癌患者放疗的剂量和强度,也不能提高其局部控制率和长期生存率。找到与食管鳞癌放射敏感性相关的关键因素,就有可能预测患者的放射敏感性,制定安全、高效、合理的个体化治疗方案,进行放疗增敏或逆转其放射抵抗,甚至开辟新的靶向治疗,实施“精准医疗”,从而提高放化疗的局部控制率和全身有效率,最终改善患者的长期生存。影响食管鳞状细胞癌放疗敏感性的因素有很多,包括细胞周期、氧合状态、细胞增殖能力、对辐射损伤的修复能力等,牵涉的内容广泛而复杂,虽然放射肿瘤界的学者、专家们已经研究了几十年,但是至今临床上仍无法有效地预测不同患者各自的放射敏感性。过去的研究已经证实了恶性肿瘤的放射抵抗与许多基因的异常表达有关,并且这些基因可以作为肿瘤治疗的潜在靶点。众所周知,恶性肿瘤的形成、进展是由多个信号通路介导的,改变单个基因是无法影响到肿瘤细胞放射敏感性的。前几年,作为肿瘤放射抵抗领域的研究热点,一批非编码微小核糖核酸(miRNAs)因其同时参与调节多个致癌途径,被证实能够影响肿瘤细胞的放射敏感性。其它有关食管癌放射敏感性的文章也时有报道,例如：在体外细胞试验中,氨基肽酶抑制剂CHR-2797被证实可以提高食管鳞癌细胞株的放射敏感性,而且其机制并不依赖于DNA诱导损伤或DNA修复动力。在食管鳞状细胞癌细胞株KES和TE-9中,丙戊酸(VPA)能够抑制DNA双链断裂修复机制中的非同源末端连接,使放射引起的DNA双链断裂作用增强,继而提高肿瘤细胞对放射的敏感性。环指蛋白2(RNF2)被报道在ECA109和TE-13细胞株以及手术切除的食管鳞癌标本中表达升高,与患者的长期生存负相关；并且敲除RNF2基因后,能够增加食管癌细胞的放射敏感性,抑制肿瘤细胞的生长。胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP-3)、X线修复交叉互补基因3(XRCC3)也曾被报道与食管鳞癌放射敏感性相关等。但是体外实验和体内实验具有显著的差异性,基础医学的研究结果,未能转化为临床治疗方面的新方法。到目前为止,医学上尚未发现与食管鳞癌放疗敏感性的关键基因或靶点。PAX9是成对盒基因家族中的一员,不仅在胚胎发育和器官形成等几个方面发挥着关键的作用,而且在肿瘤进展方面具有重要的作用。PAX9位于人14号染色体q12-q13区,具有一个由128个氨基酸组成的DNA结合配对域,能够与DNA序列特异性结合。最近10年的研究发现,人类许多恶性肿瘤中均可检测到PAX9的表达异常,且与肿瘤的发生、进展、局部浸润和远处转移密切相关。一项针对食管癌基因组测序的大型实验显示,在食管鳞癌中PAX9的扩增显著异常,说明PAX9有可能是食管鳞癌的特异基因型。我们在前期的研究中发现,PAX9表达阳性的食管鳞癌术后患者进行放疗能够得到生存获益,而未行放疗的患者预后较差,这提示PAX9或许具有放射敏感性的预测作用。于是我们推测,对不可切除的局部晚期食管鳞癌患者的放射敏感性,PAX9表达情况同样具有预测价值。研究目的本课题主要研究PAX9基因在人食管鳞癌细胞系ECA109、EC9706和TE-1中的表达情况。通过体外构建重组真核高表达PAX9质粒并转染细胞,观察PAX9基因对TE-1细胞系在抑制增殖与侵袭、促进凋亡、提高放射敏感性等方面可能发挥的重要作用。研究方法：1. ESCC细胞系培养。我们收集了3种人食管鳞癌细胞株ECA109、EC9706和TE-1,进行细胞培养和传代,采用western blotting方法检测各自PAX9基因蛋白质的表达。筛选PAX9基因表达较低的一种继续实验。2.构建体外PAX9载体。以PAX9基因的CDS区为核心区域,设计6条过表达的PAX9序列,将该序列连接到慢病毒载体骨架上,分别转化感受态Stbl3,挑选单克隆,测序验证后得到一条序列正确的慢病毒过表达载体。提取质粒并纯化后,进行慢病毒包装并感染目的细胞,Real-time PCR和western blotting实验检测PAX9基因均呈高表达,显示构建成功。3.TE-1过表达PAX9稳转细胞系的建立。将PAX9过表达载体和空载体的慢病毒感染TE-1细胞系48h后,加入G418药筛5代后,利用Real-time PCR和western blotting法检测转染细胞株PAX9基因在连续3代mRNA水平和蛋白质水平的表达情况,验证转染是否成功。4.细胞照射与MTT实验。用6MVX射线源以不同剂量照射TE-1细胞、对照vector细胞和PAX9转染细胞。24小时后,进行MTT实验,整理数据,统计分析。5.划痕实验检测各组细胞照射前(0Gy)与照射后(2Gy、4Gy和8Gy)的迁移能力并进行比较、分析。6.应用克隆形成实验探讨PAX9基因对TE-1细胞放射敏感性的作用。7.进行凋亡实验,观察各组细胞的细胞周期,分析PAX9基因对TE.1细胞放射后凋亡的作用。研究结果：1.细胞筛选：通过western blotting检测,发现EC9706, ECA109和TE-1这3种细胞的PAX9基因均为低表达状态,其中TE-1细胞的PAX9表达量最低,因此我们选择TE-1细胞系作为后续试验的细胞系。2.体外构建PAX9过表达载体,慢病毒包装后,Real-time PCR和western blotting实验检测PAX9基因均呈高表达,显示构建成功。3.将PAX9过表达载体和空载体的慢病毒感染TE-1细胞系,经G418药筛后,Real-time PCR及、Western blotting检测显示,实验组细胞感染后PAX9基因在蛋白质和mRNA水平均存在高表达情况,且与对照组及控制组相比具有统计学差异(P0.05)。4.MTT实验结果表明PAX9过表达组的细胞增殖能力下降,照射后细胞抑制率增加。与控制组和对照组相比,具有统计学意义差异(P0.05)。5.划痕实验结果显示PAX9过表达组的细胞迁移能力降低,照射以后,这种趋势更为明显。6.克隆形成实验结果显示,6MV-X射线照射后,PAX9高表达组的细胞克隆形成率明显低于TE-1控制组和空载体对照组。PAX9高表达组的较TE-1控制组和空载体对照组的放射增敏比为1.4,表明PAX9基因高表达对TE-1细胞具有较好的放射增敏作用。7.流式细胞仪检测细胞凋亡率的结果显示,PAX9高表达组接受3Gy及6Gy X线照射后的凋亡率明显高于TE-1控制组和空载体对照组,表明PAX9基因具有促进TE-1细胞照射后诱导凋亡的作用。结论：1.人食管鳞癌细胞株EC9706、ECA109和TE-1的PAX9基因处于低表达状态。2.PAX9基因能够降低TE-1细胞的增殖和迁移能力,提高其放射敏感性。3.PAX9基因可能具有食管鳞状细胞癌放射敏感性的预测价值,有助于临床为患者制定个体化治疗方案,实施精准医疗。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.1

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