HBV相关肝细胞肝癌组织中HBV cccDNA突变位点的筛选及功能研究

发布时间：2018-03-06 18:40

  本文选题：乙型肝炎病毒　切入点：共价闭合环状DNA　出处：《山东农业大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)突变与肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的相关性一直是乙肝病毒致癌作用研究的热点。然而,从感染HBV到HCC,往往经历“慢乙肝-肝硬化-HCC”这一漫长过程,加之HBV基因组易于变异和宿主的免疫选择压力,感染者体内的HBV往往存在与“野生序列”高度相关但不完全相同的变异株的动态种群,即准种。这一现象提示我们,每一个体内HBV的突变往往随着感染时间和疾病进程而逐渐增加。在既往研究中,通过比较HBV感染不同时期的患者外周血中病毒的突变情况,发现了与HCC相关的HBV突变。但由于肝癌患者血清中的HBV突变来自于肝癌组织和非癌肝组织中的cccDNA突变,并且癌组织中病毒复制能力相对较弱。因此,血清中病毒DNA的突变不能有效地反映肝癌组织中HBV cccDNA的突变情况。HBV共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)只存在于感染的肝细胞核中,是HBV复制的模板,具有一定的组织特异性。同时,为消除不同感染阶段这一时间因素对HBV变异程度的影响,本实验通过比较HCC患者配对的肝癌与癌旁组织中HBV cccDNA突变位点的差异,分析这些病毒突变的临床相关性,寻找与HCC发生、发展相关的病毒突变位点,开展与HCC发生、发展相关的病毒突变位点相应的功能研究,探索HBV基因组突变的可能致癌机制。本研究采用29例HCC患者术后的癌与癌旁组织,通过实时荧光定量PCR检测组织中HBV cccDNA和HBV total DNA水平,滚环扩增及PCR产物直接测序HBV cccDNA全基因组,与野生序列比对寻找HBV cccDNA的突变位点,并分析HBV cccDNA突变位点的临床相关性。以HBV 1.2×质粒为基础,通过定点突变技术,构建HBV 1.2×-G588C突变及HBV 1.2×-T1719G突变质粒,采用实时荧光定量PCR技术检测病毒突变位点对细胞内3.5kb RNA和total RNA及上清中HBV DNA水平的影响,用时间分辨荧光法检测病毒突变位点对细胞培养上清中HBs Ag和HBeAg含量的影响。采用双荧光素酶报告实验检测T1719G突变后是否对HBV Enh II的活性有影响,并进一步通过染色质免疫共沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay,Ch IP)-PCR技术检测T1719G突变后对HNF3β与EnhII之间结合力的影响。通过分别与野生型HBx质粒及HBx-T1719G突变型质粒共转染,检测T1719G突变的HBx蛋白对HBV复制能力的影响。研究结果如下:(1)完成了25个癌组织标本和29个癌旁组织标本中hbvcccdna的全基因组测序,其中有19对是配对的癌组织与癌旁组织。在19对hbvcccdna序列中,18对是c基因型,1对是b基因型。25个癌组织的hbvcccdna序列中23个是hbvc基因型。将所得到的18对c基因型的cccdna序列与hbv的野生序列进行比对,获得hbvcccdna全基因组的突变位点。以突变率大于10%的作为突变热点,共筛选出突变热点233个。完成了29对癌与癌旁组织hbvcccdna和totaldna的定量检测。(2)将23个癌组织中的各突变位点与患者的临床资料(术后生存时间,bclc分级、术前afp浓度等)及hbvdna定量结果进行了统计分析,结果显示t1719g、c1329a和t3098c突变与患者的术后生存时间相关,携带突变型a1329或c3098的肝癌患者术后生存时间长于携带野生型c1329或t3098的患者,而g1719突变组肝癌患者的术后生存时间短于t1719野生型组;g1078t、c1653t、g1727a、c1913a、t1978c和c3116t突变位点与患者术前高浓度的afp相关;t1719g和c1913a两个突变位点与hbvdna定量结果有统计学意义,其中,突变型g1719组hbvcccdna和hbvtotaldna含量均低于野生型t1719组,突变型a1913组hbvcccdna的含量高于野生型c1913组;我们还发现,突变位点t1719g与患者的bclc分级相关,t1719野生型组倾向于较低的bclc分级,g1719突变型组倾向于较高的bclc分级结果提示t1719g突变后患者的预后差;并且cox多因素分析结果显示t1719g突变是hcc患者术后生存时间的独立的危险预后预测因素,而t3098c突变是hcc患者术后生存时间的独立的保护预后因素。(3)g588c突变(可引起g145a氨基酸突变)只存在于3例癌组织(7c、569c、831c)中,提示g588c突变可能与hcc的发生发展有关。g588c突变型组上清中hbsag的含量低于野生型组(p0.05),g588c突变型组细胞内的hbsag的含量高于野生型组(p0.05),g588c突变型组hbsag的总量和hbv1.2×野生型组之间的差异无统计学意义(p0.05),而g588c突变型组上清中hbsag与细胞内hbsag的比值明显低于hbv1.2×野生型组(p0.05),并且,g588c突变型组上清中hbvdna水平与hbv1.2×野生型组之间的差异无统计学意义(p0.05)。结果表明g588c突变不影响hbv的复制能力,也不影响hbsag的表达,而可能影响了hbsag从细胞内向细胞外的分泌。(4)在huh7和hepg2肝癌细胞中,hbv1.2×-t1719g突变型质粒与hbv1.2×野生型质粒相比,可以明显降低培养上清中hbsag和hbeag的含量(p0.001)、细胞内HBV total RNA和3.5kb RNA水平(p0.001)、细胞培养上清中HBV DNA水平(p0.001),双荧光素酶报告实验发现,在Huh7、HepG2、SK-Hep1和HEK293T四种肝癌细胞中,T1719G突变组的Enh II的活性低于野生型组(p0.001),当野生型质粒和T1719G突变型质粒分别与HNF3β质粒共转染时,T1719G突变组的EnhII的活性也低于野生型组(p0.001),提示T1719G突变既降低了EnhII活性,又影响了HNF3β对Enh II的转录调控活性。ChIP-PCR实验结果表明T1719G突变影响了HNF3β和HBV EnhII之间的结合力,突变型G1719与HNF3β之间的结合力弱于T1719与HNF3β之间的结合力。在Huh7和HepG2细胞中,当HBV 1.2×和HBV 1.2×-T1719G质粒与HBx质粒共同转染时,与未共转染组相比上清中HBsAg和HBe Ag的水平没有明显变化(p0.05);但当HBV 1.2×和HBV 1.2×-T1719G质粒与HBx-mut质粒共同转染时,与未共转染组相比,上清中HBsAg和HBeAg的水平仍然明显下降(p0.001);并且,HBV 1.2×-T1719G质粒与HBx-mut质粒共转染组上清中的HBsAg和HBe Ag的水平低于HBV 1.2×质粒与HBx-mut质粒共转染组(p0.001);而HBV 1.2×-T1719G质粒与HBx质粒共转染组上清中的HBsAg和HBeAg的水平与HBV1.2×质粒与HBx质粒共转染组相比差异没有统计学意义(p0.05);当HBV 1.2×和HBV 1.2×-T1719G质粒与HBx质粒或HBx-mut突变质粒共同转染时,与未共转染组相比上清中HBV DNA的水平都升高(p0.001);但HBV 1.2×-T1719G质粒与HBx-mut质粒共转染组上清中HBV DNA的水平低于HBV 1.2×质粒与HBx-mut质粒共转染组,差异有统计学意义(p0.001);而HBV 1.2×-T1719G质粒与HBx质粒共转染组上清中HBV DNA的水平与HBV 1.2×质粒与HBx质粒共转染组相比,差异没有统计学意义(p0.05)。这些结果表明T1719G突变可以降低HBV的复制能力,其中突变的HBV EnhII和突变的HBx蛋白都起到了重要的作用。结果表明癌与癌旁组织中存在差异趋势的突变位点有可能是HCC发生的重要病毒学因素,通过与临床信息分析找到了一些具有临床相关性的突变位点,G588C突变可能影响HBsAg的分泌,T1719G突变与患者的BCLC分级、患者的术后生存时间有关,是HCC患者术后生存时间的独立危险预测因素,并且T1719G与HBV的复制能力有关,通过细胞水平实验证实了T1719G突变可以降低HBV的复制能力。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R512.62;R735.7

【参考文献】

相关期刊论文 前10条

1 Xiu-ting He;Hong-qin Xu;Xiao-Mei Wang;Xiu-shu He;Jun-qi Niu;Pu-Jun Gao;;Association between polymorphisms of the APOBEC3G gene and chronic hepatitis B viral infection and hepatitis B virusrelated hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2017年02期

2 王葳;何永刚;浦永兰;潘少坤;谢幼华;;乙型肝炎病毒Ⅹ蛋白的优势氨基酸序列与热点突变位点的生物信息学分析[J];微生物与感染;2016年06期

3 Hye Won Lee;Sang Hoon Ahn;;Prediction models of hepatocellular carcinoma development in chronic hepatitis B patients[J];World Journal of Gastroenterology;2016年37期

4 Chuck C K Chao;;Inhibition of apoptosis by oncogenic hepatitis B virus X protein: Implications for the treatment of hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Hepatology;2016年25期

5 Doo Hyun Kim;Hong Seok Kang;Kyun-Hwan Kim;;Roles of hepatocyte nuclear factors in hepatitis B virus infection[J];World Journal of Gastroenterology;2016年31期

6 Danbi Lee;Heather Lyu;Young-Hwa Chung;Jeong A Kim;Priya Mathews;Elizabeth Jaffee;Lei Zheng;Eunsil Yu;Young Joo Lee;Soo Hyung Ryu;;Genomic change in hepatitis B virus associated with development of hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2016年23期

7 胡威;魏肖;周凯;孔凡运;寇艳波;房贤达;李向阳;尤红娟;郑葵阳;汤仁仙;;C端截断的HBX突变体通过上调DR4和DR5表达促TRAIL诱导的肝癌细胞凋亡[J];免疫学杂志;2016年06期

8 陈珊珊;陈浩;高珊珊;周虎;邱石黎;喻明霞;涂建成;;血浆miR-205在乙肝病毒相关肝脏疾病中的表达及其作为乙肝病毒所致肝细胞癌诊断标志物的价值[J];武汉大学学报(医学版);2016年03期

9 Xiao-Ling Wang;Jian-Ping Ren;Xue-Qing Wang;Xiao-Hong Wang;Shao-Fang Yang;Yi Xiong;;Mutations in pre-core and basic core promoter regions of hepatitis B virus in chronic hepatitis B patients[J];World Journal of Gastroenterology;2016年11期

10 Yong-Wei Li;Feng-Cai Yang;Hui-Qiong Lu;Jiong-Shan Zhang;;Hepatocellular carcinoma and hepatitis B surface protein[J];World Journal of Gastroenterology;2016年06期

，

本文编号：1576021