CDC42过表达在胆管癌侵袭转移机制中的作用实验研究

发布时间：2018-03-07 00:37

  本文选题：Cdc42　切入点：67LR　出处：《第三军医大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景:胆管细胞癌是相对比较常见的消化道系统恶性肿瘤之一,随着医学科学的发展,近年来该肿瘤诊断、发现率不断提高,特别是肝外胆管细胞癌提高最为明显。作为消化道的实体性恶性肿瘤,其典型的生物学表现主要是原位膨胀及浸润生长,侵袭转移是其主要的致死原因,外科干预性治疗是目前主要的治疗方式,但不能保证胆管癌的远处、淋巴结及微小转移灶的彻底根除,术后出现复发、转移难以避免,此情况严重制约了胆管癌的手术切除效果及预后评估,通过对胆管细胞癌的深入认识,可以针对胆管癌患者提出一个综合性的治疗方案,并根据患者的具体病理特点来判断预后,而这些都需要技术和理论的支持。前期的实验研究发现,67 LR蛋白过表达的胆管癌细胞株(QBC939、RBE)其突触形成明显多于正常的胆管上皮细胞,且在mRNA水平其表达水平亦明显增高。67 LR是一种非整合素受体,多表达于消化道上皮细胞表面,一些研究表明其参与细胞与基底膜以及细胞外基质的粘附功能。另外研究表明多种组织的恶性肿瘤中67LR表达增高,并通过多种机制促进癌细胞侵袭转移。本实验室前期实验已发现胆管细胞癌中67LR过表达,显著促进癌细胞侵袭。我们猜想在67LR高表达细胞株中出现的突触形成增多,是否为67LR过表达促进了突触形成或启动,直接或间接的激活了突触形成的信号分子。在肿瘤细胞中,突触形成是与Rho GTP酶密切相关的。RHO GTP酶是一类Ras相关的信号分子,在肿瘤中可出现异常的激活或抑制。Rho GTP酶可以将GDP偶联去活化为GTP形式,活性形式可以结合一定数量的效应分子,信号级联放大,从而调控各种细胞过程。Rho其家族成员主要包括有Rho A、Rho B、RhoC、Rac1、Rac2、Rac4、Cdc42等多个分子,该族成员分子为细胞内重要的信号中间参与分子,例如Rho A诱导张力纤维的形成,Racl诱导细胞板状伪足和细胞膜皱壁的形成,Cdc42是Rho家族蛋白(Rho GTPase)中的重要成员之一,主要参与细胞侵袭足的形成等,并可通过参与激活下游的信号分子及效应分子产生一系列的生物学反应,从而调控细胞的骨架重构及细胞极性的变化。近年研究发现,Rho家族分子与不同的组织来源所起到的作用不同,在某些恶性肿瘤的(乳腺癌、头颈部肿瘤等)出现cdc42的高表达情况,而在某些肝脏病变及血液系统肿瘤中出现cdc42低表达的表型。我们将针对67lr过表达的出现的体外细胞株突触(侵袭足)增多情况,研究cdc42在胆管细胞癌中表达模式情况如何。67lr过表达是否通过影响cdc42,进而促进胆管癌细胞侵袭转移。目的:应用免疫组织化学(immuno-histochemistry,ihc)、real-timepcr、免疫荧光、westernblot方法从组织蛋白和mrna水平检测cdc42蛋白的表达水平,探讨在临床上明确诊断的胆管细胞癌中cdc42的表达水平与患者临床病理参数的相关性以及cdc42在胆管癌患者预后评估中的作用和意义。并研究67lr过表达调控cdc42影响胆管癌细胞的侵袭转移的可能机制。材料方法:1.根据免疫组化染色的阳性细胞数目以及染色强度对cdc42的表达量进行半定量分析,采用免疫组化染色的方法对87例胆管癌标本、23例淋巴结转移灶和18例远处转移灶标本(2005-2010行胆管癌手术治疗患者标本),并对比淋巴结转移及远处转移灶与原发灶中cdc42的表达差异。2.cdc42蛋白表达量与胆管癌临床病理参数相关性分析,cdc42表达量与胆管癌患者生存率的相关性采用kaplan-meier法分析并用log-rank检测;采用cox多元线性回归分析所有涉及的临床病理指标,评估其对胆管癌患者总生存时间和无瘤生存时间的影响。3.构建cdc42干扰和过表达载体,转染胆管癌细胞株(qbc939和rbe),干预cdc42表达;通过划痕实验、transwell侵袭实验,研究cdc42对胆管癌细胞迁移、侵袭和转移能力的影响。4.采用免疫组化观察87例胆管癌组织中67lr的表达情况,分析67lr和cdc42表达的相关性。构建67lr干扰和过表达载体,转染胆管癌细胞(qbc939和rbe);通过real-timepcr、western-blot实验,研究胆管癌细胞中干预67lr表达对cdc42表达的影响;采用染色质免疫共沉淀(chip)实验,研究胆管癌细胞中cdc42能否与67lr基因启动子结合。通过western-blot实验,研究胆管癌细胞中干预67lr表达对活性cdc42表达的影响。研究结果1.明确诊断的胆管癌切除组织标本中(87例),34例癌组织(39%)呈现cdc42胞浆染色阳性;而24例癌旁组织cdc42有4例呈阳性(17%),而其余染色阴性;提示胆管癌中存在cdc42异常高表达具有统计学意义(p0.01)。分析cdc42表达与患者临床病理特性相关性提示:cdc42阳性表达与淋巴结转移、远处转移显著相关,而与患者性别、年龄、原发灶tnm分级、组织分化程度无关。32例淋巴结转移灶中,25例(78%)出现cdc42染色阳性,阳性率显著高于原发灶(39%);18例远处转移灶中,13例(75%)呈cdc42染色阳性,其阳性率也高于原发灶;这些结果提示:胆管癌中cdc42异常表达与肿瘤侵袭转移相关。2.kaplan-meier分析结果显示:cdc42阳性表达的患者术后总存活时间显著低于cdc42阴性组患者(log-rankp=0.002);而其肿瘤复发显著早于cdc42阴性表达的患者(log-rankp=0.002)。cox模型分析提示:cdc42异常表达是判断病人术后存活时间和肿瘤复发时间的相对独立危险因素(hr=2.047,95%ci=1.414-3.581,p=0.002;hr=1.892,95%ci=1.315-3.203,p=0.003)。本部分结果提示:cdc42异常表达可能是判断胆管患者预后的潜在分子标志。3.利用体外胆管癌细胞株(qbc939、rbe)免疫荧光检测,观察cdc42在两株细胞间的差异,并通过划痕实验、transwell侵袭实验,得出qbc939细胞株中干扰cdc42表达显著抑制癌细胞的侵袭和迁移能力;而rbe细胞株中过表达cdc42明显增强癌细胞的侵袭和迁移能力。本部分实验提示:cdc42过表达可能促进胆管癌细侵袭转移。4.明确诊断的胆管癌切除组织标本中(87例),35例(40%)呈现67lr膜染色阳性。卡方检验提示67lr表达与cdc42表达情况显著相关。连续切片免疫组化发现:67lr和cdc42在胆管癌组织的表达具有相对的一致性。5.在体外胆管癌细胞株(qbc939)中干扰67lr的表达,cdc42的mrna和蛋白表达无明显变化。在胆管癌细胞株(rbe)中上调67lr的表达,cdc42的mrna和蛋白表达无明显变化。chip实验结果提示qbc939和rbe细胞中cdc42与67lr基因启动子区无结合。通过westernblot检测发现qbc939中干扰67lr的表达,活性cdc42的表达降低,rbe中上调67lr表达,活性cdc42的表达增强。本部分结果提示胆管癌细胞株体外体外实验中,67lr可能通过增强cdc42的活性形式的促进胆管癌的侵袭作用。结论:1.利用ihc、westernblot、以及pcr等分子生物学研究手段发现cdc42在胆管细胞癌中存在异常高表达;2.cdc42表达量与肿瘤的淋巴结及远处转移具有统计学意义上的相关性;并与胆管癌的预后密切相关。3.67LR可能通过调节Cdc42的活性形式促进胆管癌细胞侵袭转移。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.8

【参考文献】

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1 Tosikazu AMANO,Olivia KWAK,Anastasia MARSHAK;The matrix metalloproteinase stromelysin-3 cleaves laminin receptor at two distinct sites between the transmembrane domain and laminin binding sequence within the extracellular domain[J];Cell Research;2005年03期

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本文编号：1577227