FoxM1抑制剂下调Rad51增加顺铂对骨肉瘤耐药细胞的化疗敏感性

发布时间：2018-03-07 12:30

  本文选题：骨肉瘤　切入点：化疗耐药　出处：《安徽医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤,主要发生于青少年。虽然尝试新辅助化疗后,骨肉瘤生存率明显提高。然而,自上世纪80年代以来骨肉瘤的治疗未见明显提高,可能与骨肉瘤发生耐药相关。化疗耐药发生的机制有多种,近年来研究发现DNA损伤修复是导致化疗耐药的因素之一。DNA修复基因Rad51是同源重组修复的关键蛋白,同源重组修复是DNA损伤修复的重要修复形式。多种研究表明Rad51在肿瘤中高表达,且与耐药密切相关。FoxM1是与增殖密切相关的转录因子,在细胞周期的调控中发挥重要作用。近年研究发现FoxM1与肿瘤的发生发展密切相关,在多种恶性肿瘤中表达明显升高,且通过调节DNA损伤修复基因参与耐药。本实验为探讨FoxM1是否通过调控DNA修复基因Rad51参与顺铂(CDP)对骨肉瘤耐药细胞化疗抑制作用。方法以骨化性肌炎组织为对照组,骨肉瘤组织为实验组,采用免疫组化方法检测骨肉瘤组织中FoxM1的表达;以骨肉瘤细胞系MG-63和HOS-MNNG为亲本细胞系,采用大剂量冲击和逐步增加剂量相结合的方法诱导骨肉瘤耐药细胞系,实验起始用0.1μ g/mL CDP培养细胞24h,撤药培养至细胞稳定传代,如此重复3次后增加药物剂量至0.2μ g/mLCDP培养24h,撤药培养至细胞稳定传代,按以上方法如此大剂量冲击和逐步增加剂量相结合逐步增加剂量诱导近4个月后建立的骨肉瘤耐药细胞系。采用MTT法检测耐药细胞耐药指数(RI)。qRT-PCR法检测耐药细胞与亲本细胞FoxM1和Rad51的mRNA水平的表达;Western blot检测耐药细胞与亲本细胞FoxM1和Rad51的蛋白水平的表达;耐药细胞中运用FoxM1-shRNAs敲低FoxM1后检测Rad51的mRNA及蛋白水平的表达变化;耐药细胞中加入4μ mol/L Thiostrepton处理前后检测FoxM1和Rad51的mRNA及蛋白水平的表达变化;细胞计数法检测单独或联合运用4μ mol/L Thiostrepton和2μ g/mL CDP对骨肉瘤耐药细胞增殖率的影响。结果免疫组化结果显示骨肉瘤组织中FoxM1阳性表达率较骨化性肌炎组织明显增高。采用大剂量冲击和逐步增加剂量相结合的方法,建立在2μ g/mL CDP浓度中稳定生长的耐药细胞系,并分别命名为MG-63/R和HOS-MNNG/R;MTT法检测两耐药细胞系MG-63/R和HOS-MNNG/R对CDP的耐药指数分别为30.52和37.87两耐药细胞系均显示对CDP重度耐药。qRT-PCR法检测FoxM1和Rad51的mRNA表达水平在耐药细胞中表达较亲本细胞明显增高;Western blot法检测FoxM1和Rad51的蛋白表达水平在耐药细胞中表达较亲本细胞明显增高;耐药细胞中运用FoxM1-shRNAs敲低FoxM1后检测Rad51的mRNA及蛋白水平表达均降低;耐药细胞4μ mol/L Thiostrepton处理后FoxM1及Rad51的mRNA和蛋白水平表达均明显降低。在耐药细胞中联合运用4μ mol/L Thiostrepton和2μ g/mL CDP组较单独应用4μ mol/L Thiostrepton组或2μ g/mL CDP组细胞增殖率明显降低。结论本研究发现FoxM1及Rad51在骨肉瘤耐药细胞中高表达,运用FoxM1-shRNAs和FoxM1抑制剂Thiostrepton可下调Rad51的表达。在耐药细胞中联合运用Thiostrepton和CDP导致细胞增殖率明显降低,表明抑制FoxM1可能增加耐药细胞对化疗的敏感性。本研究结果提示联合应用FoxM1抑制剂和化疗药物可能提高骨肉瘤耐药治疗的疗效,为骨肉瘤耐药机制及治疗提供新的靶点。
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【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R738.1

【参考文献】

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1 蒋智铭,张惠箴,陈洁晴,黄瑾,刘亮;骨肉瘤的组织学类型[J];临床与实验病理学杂志;2004年02期

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本文编号：1579304