MicroRNA-432通过E2F3及AXL调控肺腺癌的研究

发布时间：2018-03-08 13:55

本文选题：miRNA-432　切入点：肺腺癌　出处：《青岛大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：肺腺癌是非小细胞肺癌中最常见的病理类型,且近几十年在很多国家(包括中国)的发病率呈现显著增长趋势。肺癌的发生是一个复杂的、循序渐进的过程,其中包含了许多基因突变等过程,目前已有许多研究致力于揭示其中的机制。近年来,miRNA在肺腺癌中的作用引发了研究者们极大的兴趣,并且调整miRNA的表达对肺腺癌的增殖、转移及化疗药物抵抗均有重要的作用。尤为重要的是,其在组织、血清及唾液中不正常的表达量也可作为肺腺癌患者诊断及预后的指标。肺腺癌中许多miRNA表达不正常,但其机制不明,我们期望可以发现更多的miRNA在肺腺癌发生发展过程中的作用。之前的研究中我们报道过miRNA在许多肿瘤中低表达,如肝癌、卵巢癌和宫颈癌等。功能性研究表明,他在不同种类的细胞中扮演着癌基因或抑癌基因的功能。例如,miR-432下调ADAR1表达,进而促进恶性淋巴瘤细胞的增殖。相反的,miR-432通过调节LRP6,TRIM29和Pygo2,进而通过Wnt/β-catenin信号通路抑制肝癌细胞的增殖。相似的,它可以通过调节成神经细胞瘤的癌基因NESTIN/NES,RCOR1/COREST和MECP2,使细胞停滞在G0-G1期,从而降低细胞增殖。荟萃分析显示miR-432表达水平对于无复发生存期是一个独立的预后因素。然而,miR-432在肺腺癌中的表达和功能,以及其下游基因目前仍不清楚。本研究中,我们发现miR-432的表达可以明显的抑制肺腺癌组织生长,且其表达水平与肿瘤临床分期密切相关。并且,Kaplan-Meier生存分析也显示,miR-432低表达与肺腺癌患者的肿瘤特异性死亡相关。我们做了体内外实验,在功能和机制上阐明miR-432过表达可抑制肺腺癌细胞增殖和肺腺癌形成。进一步,我们发现miR-432过表达可增加肺腺癌细胞对顺铂的敏感性,E2F3和AXL是miR-432作用于肺腺癌的靶点。总之,我们的研究发现miR-432的异常表达对肿瘤的发展和耐药是一个重要的影响因素,提示miR-432是一个潜在的肺癌治疗靶点。研究目的1.明确miRNA-432在肺腺癌组织中的表达情况,及其表达情况与肺腺癌肿瘤分期的关系,miRNA-432表达与Ki-67表达的关系,寻找新的肺腺癌肿瘤标志物。2.探索miRNA-432表达与肺腺癌细胞细胞周期的联系,以明确miRNA-432调节肺腺癌细胞增殖的机制。3.阐明mirna-432表达与e2f3及axl表达的关系,以明确mirna-432通过何通路起到调节肺腺癌发生及发展的作用。4.探索肺腺癌对顺铂耐药的机制,寻求通过调节mirna-432逆转肺腺癌细胞对顺铂耐药的可能性,以最终提高肺腺癌患者对治疗的疗效,延长肺腺癌患者的生存期。研究方法1.肿瘤样本:所有的肿瘤样本均来自于临沂市人民医院自2009年10月至2015年5月诊断的患者,经手术切除得到肿瘤样本。所有参与研究的患者均签署知情同意书。患者的组织病理学诊断均根据修订的国际肿瘤分期进行。取得的肺腺癌患者肿瘤样本均未经化疗及放疗治疗。共随访278例患者,时间从1月到78月(中位随访时间48月)。实验流程已通过山东大学医学院伦理委员会。2.细胞系及细胞培养:人肺癌细胞系(a549和h1299)由atcc购得。a549和h1299细胞系在含10%fbs的rpim-1640培养液中培养。细胞培养环境为5%co2、37℃。3.mts方法:在体外利用mts方法测定肺腺癌细胞的生长。将5000个细胞加入到96孔板中,将mirna、sirna和对照调整浓度为50nm,转染细胞。检测时,将20μl的mts加入到每个孔中。96孔板在37℃孵育1小时,室温摇晃10分钟。在495nm测定吸收率,实验重复三次。4.brdu细胞增殖法:细胞重复5次加入到96孔板,调整细胞密度至2×104每孔。待细胞贴壁后,用mir-432和对照转染细胞。根据操作流程(merckmillipore)通过测定brdu吸收率以明确细胞增殖。brdu吸收率利用化学发光法测定(吸光度:450nm)。5.提取rna及实时定量pcr:石蜡包埋的组织切成10mm厚切片,脱蜡、水化后,苏木精染色。利用解剖显微镜(leicaaslmd,wittsbaden,germany)观察及显微解剖肿瘤组织。使用mirneasyffpe试剂盒(qiagen,hilden,germany)提取mirna,此试剂盒可将福尔马林固定的和石蜡包埋的组织切片中的所有rna,包括mirna全部提取纯化出来。利用genecopoeia,inc.合成人mir-432的引物序列和小核rnau6,根据操作说明利用sybrprimescriptmirnart-pcr试剂盒和sybr?greeni(toyobo,osaka,japan)测定它们的表达量。所有小核rnau6的表达量用以作为mirnas表达量的内参。培养的细胞中全部rna的提取及e2f3和axl的定量方法如前所述。利用pcr产物的熔解曲线验证目标产物的扩增情况。6.sirna及质粒的构建:根据操作流程利用lipofectamine2000构建sirna,空载体,mirna-432转染仿制品及抑制物。模拟组的定义为仅加入转染试剂的补充组。野生型和突变型e2f33’-utr和axl3?-utr由mir-432的目标识别位点产生(种子序列)。利用saci和xhoi酶切位点将野生型和突变型的e2f3和axl的3?端基因非编码区克隆到pmirglo双荧光素酶报告载体。将人e2f3和axl基因亚克隆到pcdna3.1真核表达载体构建。7.mirna靶基因预测,荧光素酶活性检测和western印迹法:使用targetscan和miranda分析mirna的预测靶点及其目标靶位点。hek293t细胞瞬时转染携带野生型或突变的靶序列的mirna靶pmirglo双荧光素酶表达载体与mirna仿制物/抑制剂和仿制物/抑制剂对照组。细胞转染48h后制备提取物,renilla荧光素酶比例用双荧光素酶报告基因检测系统检测(promegacorp,madison,wi,usa)。抗-e2f3(ab50917,abcam),抗-axl(ab37861,abcam)和抗-gapdh(cellsignaling,danvers,ma,usa)兔多克隆抗体用以进行westernblotting。8.免疫组化:免疫组化染色根据操作说明使用标准化标记的链霉亲和素(lsab)试剂盒(dakocytomation,carpinteria,ca,usa)完成。玻片以兔多克隆抗体抗-e2f3(1:100稀释,abcam,cambridge,ma,usa),抗-axl(1:100稀释,cambridge,ma,usa)或小鼠单克隆抗体抗-ki67(1:100稀释,dako,carpinteria,ca,usa)共孵育。肺腺癌样品中的蛋白质染色强度记录方式如前。如石蜡包埋组织中10%或以上的医保观察到免疫反应阳性,则免疫组化定义为“高”,如免疫反应阳性细胞百分比低于10%,则免疫组化定义为“低”。9.流式细胞分析:按照之前的描述转染细胞,用5g/ml的阿非迪霉素(sigma-21aldrich,munich,germany)再处理24小时。经固定后,将a549和h1299细胞以1ml碘化丙啶染色(0.1mg/ml溶液中含0.1%tritonx-100),在黑暗中孵育30分钟。样品通过流式细胞仪分析(facscalibur,bd,franklinlakes,nj,usa)。10.体内实验:6周龄雄性balb/c裸鼠严格按照国家卫生研究院的的照看和使用实验室动物的指导建议进行。该操作流程由山东医学科学院科学调查委员会批准。由负载mir-432-egfp的腺病毒或其阴性对照转染肺癌细胞a549,收获细胞并悬浮于matrigel/rpmi(1:1)中。在裸鼠皮下注射5×105个细胞。每周以卡尺测量移植瘤生长。6周后处死小鼠,将肿瘤切除、称重。11.统计学分析:实验数据至少包含三次独立实验,取平均值±平均标准误差。采用student’st检验比较两组间差异,采用单因素方差分析比较两组以上组间差异。mir-432表达与临床病理学参数之间的关系以spearman法分析。kaplan-meier法分析后续的数据。p0.05则认为差异具有统计学意义。所有数据采用graphpad5.0进行分析(graphpad,ca)。研究结果1.mir-432在肺腺癌中低表达:我们对比分析了25个mirna在肺癌及癌旁组织的表达。11种mirna,包括mir-329,mir-202,mir-432,mir-302,mir-1470,mir-290,mir-514,mir-184,mir-625,mir-382和mir-689在肺腺癌组织中的表达明显低于正常组织。基于之前的研究,我们选定mir-432为继续研究的对象。首先,我们分析了278例肺腺癌组织和30例正常肺组织的mir-432表达,研究证实mir-432在肿瘤组织中的表达明显低于正常组织。接着,我们研究发肿瘤分期越晚mir-432表达越低。这些研究表明mir-432在肺腺癌病理进展中的潜在作用。为了阐明mir-432在肺癌中的作用,我们首次分析了肺腺癌患者mir-432表达与各临床病理参数的关系。我们发现,mir-432的低表达与临床分期的升高有着明显的相关性(p=0.030)。我们还利用生存分析研究了mir-432表达的高低与肿瘤患者生存的相关性,高表达mir-432的患者有着更低的死亡率,而mir-432低表达的患者死亡率更高(p=0.036)。ki-67是一个经典的增殖标志物,既往的研究发现ki-67是肺腺癌患者预后的一个独立的影响因素。本研究中,免疫组化分析了肿瘤组织中ki-67的蛋白表达量,研究发现,肺腺癌组织中,ki-67表达与mir-432表达呈显著负相关(p=0.016)。2.体外及体内实验证实mir-432调节肺腺癌的增殖:我们选择了a549细胞和h1299细胞来研究mir-432对肺腺癌的生物学效应。向肺腺癌细胞中导入mir-432明显使得肺腺癌细胞过表达mir-432。正如我们预期的,mts检验证实异常表达的mir-432显著降低了a549细胞和h1299细胞的增殖率。而过表达mir对照的细胞的增值率与未导入的细胞并无差异。进一步,我们在体外通过应用mir-432抑制剂研究mir-432缺失的功能性分析。研究结果表明mir-432抑制组较对照组有着更强的细胞活性,a549细胞和h1299细胞均得到此结果。进而,我们进行了针对dna的brdu吸收率分析,结果表明,mir-432过表达的细胞明显吸收率更低,而对照组细胞吸收率明显更高。相对的,mir-432抑制组显示出相反的实验结果。为了证实这种现象的发生是否是由于细胞周期紊乱造成的,我们继续针对细胞周期做了相关实验。我们发现,在阿非迪霉素治疗中,超过60%的细胞为g1期,不同的组别中细胞周期的组成无明显差异。然而,当撤销阿非迪霉素的作用后,过表达的mir-432使得a549细胞和h1299细胞显著的停滞在s期,这表明mir-432对抗肺腺癌增殖的作用是部分依靠调节细胞周期实现的。为了研究mir-432在体内抑制肿瘤细胞增殖的作用,我们应用了一种逆转录病毒过表达的方式以验证mir-432可以在肿瘤异种移植模型中起到抑制肿瘤基因的作用。我们的研究结果显示,转录了mir-432的肿瘤细胞形成的肿瘤组织较对照组及空白组体积更小质量更轻。综上所述,这些结果说明mir-432在肺腺癌肿瘤中的作用为肿瘤抑制物。3.mir-432可以直接抑制e2f2和axl:为了探索mir-432对肺腺癌肿瘤组织的抑制作用的机制,我们应用了一种公开的算法(targetscanandmiranda)来预测人体中mir-432的潜在靶点。进而,我们还基于geneontology(go)选择除了它们当中与肺腺癌相关的那些靶点。接下来,因为已有报道证实e2f2和axl为癌基因,可以促进多种肿瘤细胞增殖和耐药,并且结合之前的结果说明mir-432对肺腺癌有潜在的肿瘤抑制作用,我们选择了e2f2和axl进行接下来的研究。正如预期的,westernblotting证实a549和h1299细胞中e2f2和axl的表达因转染了mir-432而大幅下降,而加入了mir-432抑制剂的细胞e2f2和axl表达明显上升。为了探讨肺腺癌中mir-432对e2f2和axl的调节作用,我们首先利用rt-qpcr得到它们的基础水平。mir-432在a549细胞中的表达较h1299细胞中低,e2f2也相对的在a549细胞中的表达较h1299细胞中低,axl在h1299细胞中表达较a549细胞中高。我们进一步利用荧光素酶法验证e2f2和axl是否为mir-432的直接靶点。我们的结果表明,mir-432的异常表达使得hek193t细胞中e2f2和axl的3’utrs荧光素酶活性降低。然而,一个在序列中有4个核苷酸改变的突变mir-432对荧光素酶的活性无抑制作用。基于之前我们的实验发现mir-432在a549细胞中的表达低于h1299细胞,我们在a549细胞中过表达了mir-432。我们发现mir-432的过常表达使得a549细胞中e2f2和axl的3’utrs荧光素酶活性降低。而在h1299细胞中抑制mir-432使得e2f2和axl的3’utrs荧光素酶活性升高。值得注意的是,这些现象在通路中存在突变时则消失。这些结果表明,在肺腺癌细胞中,mir-432抑制e2f2和axl的靶点为其3’utrs。4.上调mir-432在体外提高a549细胞和h1299细胞对顺铂的敏感性:之前的研究表明mirna的异常调控与肿瘤(包括肺癌)的化疗耐药相关。鉴于有研究发现mir-432在卵巢癌中与药物耐药相关,我们猜想在肺腺癌中mir-432亦有相同的作用。为了证实我们的想法,我们在不同的时间点以顺铂(5μg/ml)作用于对照组及mir-432抑制组的a549细胞和h1299细胞。正如预期的,顺铂在不同时间点对空白组和对照组的细胞的生长率起到了抑制作用。然而,mir-432抑制组的a549和h1299细胞在顺铂作用下的细胞活性降低效应明显被削弱,这意味着mir-432可能与肺腺癌的顺铂敏感性相关。接下来,我们过表达了mir-432以明确其在肺癌细胞系a549和h1299对顺铂敏感性中的作用。正如我们预期的,过表达mir-432的肺癌细胞系较对照组的细胞活性更低。与对照组相比,转录mir-432的a549和h1299细胞在不同的药物浓度下均对顺铂有更高的敏感性。并且流式细胞仪分析也显示,相较于对照组,过表达mir-432可以明显增加顺铂作用下引起的a549细胞和h1299细胞凋亡。这些结果进一步证实了mir-432可以调节a549细胞和h1299细胞对顺铂的敏感性。为了证明mir-432与e2f3/axl的关系,我们测定了a549细胞和h1299细胞中mir-432与e2f3/axl的表达。正如预期的,与0h时间点的对照组不同,数据显示顺铂可以上调mir-432的表达。有意思的是,这种mir-432表达随顺铂调高的现象以剂量和时间依赖的方式显示出来。并且,e2f3和axl的mrna水平明显下降。进一步的剂量依赖分析研究显示,a549和h1299细胞中e2f3和axl的表达水平随转录mir-432的水平而降低。5.e2f3和axl表达的降低在功能上与mir-432对肺腺癌的生物学效应密切相关:值得关注的是,当在转录mir-432的a549和h1299细胞中过表达e2f3和axl,转录mir-432造成的对细胞活性的降低被弱化了,或者说被部分弱化了。再加上,沉默e2f3和axl可以明显使mir-432抑制组的细胞活性下降。同样的,在顺铂的作用下,过表达e2f3和axl亦可使转录mir-432造成的细胞活性降低效应消失。相对的,沉默e2f3和axl可以明显使mir-432抑制组造成的细胞活性上升现象消失。这些结果均显示出e2f3和axl在mir-432对肺腺癌作用中的重要作用。6.mir-432与其靶点在肺腺癌中的临床相关性:我们进一步证实了在人肺腺癌组织中,mir-432与其靶点的表达水平有何相关性。实验证实,mir-432表达水平与e2f3和axl的表达水平呈负相关,这证明了mir-432和e2f3/axl与肺腺癌病理学进展的相关性。研究结论1.mirna-432在肺腺癌组织中低表达,肺腺癌肿瘤分期越晚期mirna-432表达越低,mirna-432表达越高肺腺癌患者生存期越长。2.调高mirna-432表达,肺腺癌细胞活力下降,细胞更多的停滞于s期,mirna-432通过调节细胞周期调节肺腺癌细胞增殖。3.mirna-432表达与e2f3及axl表达呈负相关,mirna-432通过调节e2f3和axl起到调节肺腺癌发生及发展的作用。4.调高mirna-432可逆转肺腺癌细胞对顺铂的耐药性,以提高肺腺癌患者对治疗的疗效。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R734.2

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