肝细胞肝癌ERK磷酸化水平与索拉非尼敏感性关系和机制的研究

发布时间：2018-03-08 19:56

  本文选题：肝细胞肝癌　切入点：pERK　出处：《浙江大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景：肝癌是仅次于肺癌的全球第二大癌症死因,具有起病隐匿、复发率高、转移性强的特点。近年来,分子靶向药物在肿瘤治疗领域越来越受到关注,其在中晚期肝癌治疗上也表现出独特的抗癌效果。索拉非尼是第一个被美国FDA批准用于治疗中晚期肝癌的分子靶向药物。但在临床运用中,索拉非尼的有效性受到了极大挑战。据文献报道,在亚洲人群中,只有小部分病例对索拉非尼治疗敏感,而大部分患者经索拉非尼治疗后出现耐药,有的甚至会出现肝癌进展。因此,深入研究索拉非尼治疗肝癌的分子机制,探索肝癌对索拉非尼敏感性相关分子,从而进一步发现有效可靠的生物靶标,对肝癌的个体化治疗无疑具有非常重要的意义。虽然目前对于索拉非尼治疗肝癌的敏感性相关生物靶标已经有了较多的探索,陆续有文章报道认为VEGFA、VEGF、αB-Crystallin、FGF3/FGF4、Nanog、 EGFR/HER-3、STAT3等都可能是肝癌对索拉非尼敏感性相关的候选生物靶标。但是这些研究仍有缺陷,一方面没有系统的阐明两者之间的关系,另一方面,作为肝癌对索拉非尼敏感性的分子靶标,其依据也不够充分。探寻一种确实可靠的敏感性标记分子对于索拉非尼的个体化肝癌治疗是非常亟需的。目的：本课题旨在研究肝癌pERK水平与索拉非尼的敏感性关系。在对索拉非尼敏感性不同的肝癌患者中,比较pERK的蛋白水平,据此观察肝癌pERK蛋白水平与索拉非尼敏感性之间的关系。在此基础上,通过体内外实验以及CRISPR-Cas9基因编辑技术筛选肝癌对索拉非尼敏感性相关的关键基因,从而为肝癌的个体化治疗提供借鉴。方法：1.收集经索拉非尼治疗的肝癌患者临床资料,观察索拉非尼对不同pERK蛋白水平肝癌的敏感性。2.比较不同pERK蛋白水平的肝癌细胞系对索拉非尼的敏感性。3.建立病人来源移植瘤模型(PDX模型),进一步在临床标本水平验证不同pERK蛋白水平对索拉非尼的敏感性。4.建立鼠来源异体皮下移植瘤模型(Syngenic模型),进一步在动物水平验证不同pERK水平细胞系的移植瘤对索拉非尼的敏感性。5.建立裸鼠原位移植瘤模型(orthotopic模型),进一步在动物水平验证不同pERK水平细胞系的原位移植瘤对索拉非尼的敏感性。6.建立DDBlF/F;Alb-Cre~(+/-)小鼠自发性肝癌模型,检测pERK水平和对索拉非尼的敏感性。7.建立DEN诱导小鼠肝癌模型,检测pERK水平和对索拉非尼的敏感性。8.通过苏木精伊红染色和免疫组织化学染色,比较临床资料中不同pERK水平肝癌的病理学差异。9.通过苏木精伊红染色和免疫组织化学染色,比较DDBlFF;Alb-Cre~(+/-)小鼠自发性肝癌模型和DEN诱导小鼠肝癌模型的病理学差异。10.通过转录组测序,比较pERK高和pERK低的PDX模型中基因表达改变。11.通过转录组测序,比较pERK高(HepG2)和pERK低(Li-0010)肝癌细胞系的基因表达差异。12.在病人标本中,通过qPCR的方法验证转录组测序结果。13.通过对索拉非尼敏感的HepG2细胞进行CRISPR-Cas9全基因组敲除筛选其敏感基因。14.在HepG2细胞中改变筛选得到的候选基因的表达,观察对索拉非尼敏感性的影响。15.用免疫组织化学以及免疫荧光染色法,检测pERK和PDl在临床肝癌病人标本中的水平。结果：1.索拉非尼对pERK水平高的肝癌患者更加敏感。2.体外实验证明pERK高的肝癌细胞系HepG2、Hepal-6比pERK低的肝癌细胞系Be17404.Hepalclc7对索拉非尼更加敏感。3.在PDX模型中,索拉非尼对pERK蛋白水平高的肝癌模型个体更加敏感。4.将pERK高的肝癌细胞系Hepal-6和pERK低的肝癌细胞系Hepalcl c7分别种植到C57BL/6J小鼠建立Syngenic模型,发现两者在小鼠体内微环境下的pERK蛋白水平均升高。5.将pERK高的肝癌细胞系HepG2和pERK低的肝癌细胞系Bel7404分别种植到裸鼠肝脏建立orthotopic模型,发现两者在裸鼠肝体内微环境下的pERK蛋白水平均有改变。6.DDBlF/F;Alb-Cre~(+/-)小鼠自发性肝癌模型pERK含量低,对索拉非尼不敏感。7.DEN诱导小鼠肝癌模型pERK含量高,对索拉非尼较敏感。8.临床资料病理结果显示pERK水平低的肝癌炎症细胞浸润更加明显,尤其以PD1~+CD8~+T细胞为主。9.DDBlFF:Alb-Cret~(+/-)小鼠自发性肝癌模型较DEN诱导小鼠肝癌模型表现出更多的炎症细胞浸润,以PD1~+CD8~+T细胞为主。10.转录组测序结果显示pERK低的较pERK高的PDX模型具有更强的上皮间质转化倾向。11.转录组测序结果显示pERK低的(Li-0010)比pERK高的(HepG2)肝癌细胞系具有更强的上皮间质转化倾向。12.在病人标本中,mRNA水平进一步证明pERK低的比pERK高的肝癌具有更强的上皮间质转化倾向。13. KEAP1可能在HepG2对索拉非尼的敏感性中发挥了比较大的作用。14.敲除了KEAP1的HepG2细胞对索拉非尼不敏感。15.pERK低同时伴PD1~+的肝癌患者在所有肝癌中占了多数。结论：1.索拉非尼对pERK蛋白水平高的肝癌患者更加敏感。2. pERK蛋白水平低的肝癌炎症细胞浸润更加明显,尤其以PD1~+CD8~+T细胞为主。3. pERK低的肝癌较pERK高的肝癌具有更强的上皮间质转化倾向。4. KEAP1可能在pERK含量高的肝癌对索拉非尼的敏感性中发挥了比较大的作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7

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本文编号：1585335