乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活性与肝癌发生的关系

发布时间：2018-03-09 15:46

  本文选题：DEN　切入点：肝纤维化　出处：《郑州大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：肝癌(liver cancer)是最常见威胁人类健康的肝脏恶性肿瘤。肝炎-肝硬化-肝癌,这一发展模式得到支持。肝纤维化是各种慢性肝病共同的病理学特征,也是慢性肝病进展到肝硬化的必经阶段。乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenases,ADH)和乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenases,ALDH)主要存在于肝细胞中。ADH主要参与乙醇代谢,乙醇经氧化生成乙醛,乙醛具有肝脏毒性,能诱发癌症。同时ADH也参与视黄醇代谢,视黄醇及其代谢物参与肝炎及肝纤维化的进程,近期结果也显示ADH的缺乏能抑制肝纤维化。据报道,和癌旁的正常组织相比,肝癌组织中ADHI活性出现升高。肝癌患者血清中ADH活性较健康人也出现升高。本室前期结果显示,和正常肝组织相比,肝癌患者的肝纤维化组织中总ADH、ADHI、ADHII酶活性均明显升高,而总ALDH和ALDH2酶活性没有改变。上述结果显示,ADH活性升高可能和肝纤维化甚至肝癌存在关系,但肝癌发展的各个阶段血清和组织中ADH活性是如何改变的,ADH活性的升高是肝损伤的结果还是原因,其升高是否存在对肝损伤的易感性有待实验进一步研究。本实验拟选择二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine,DEN)制备的大鼠肝癌模型为研究对象,测定大鼠在诱导的不同阶段ADH活性,分析大鼠血浆中ADH基础活性和肝损伤相关指标的相关性,并分析肝组织中ADH、ALDH活性和肝损伤相关指标的相关性,以期探讨ADH在肝纤维化甚至肝癌发展中所起的作用。方法1大鼠肝癌模型建立1.1动物分组和给药方法54只SD雄性大鼠,分成2组,对照组10只,模型组44只,适应性喂养后,模型组1-4周腹腔注射50 mg/kg DEN,每周两次,5-14周改为腹腔注射50mg/kg DEN,每周一次,在诱导至12周时随机处死20只模型组大鼠,命名为模型A组。剩余大鼠继续按照上述方法给药,14周给药结束后继续饲养,于19周处死,此组大鼠命名为模型B组。对照组10只大鼠在19周处死。1.2动物观察与取材每天观察大鼠生理和精神状态,每周记录大鼠体重,对照组和模型B组于给药前第0周,及开始给药后第8、12、16、19周留取大鼠血浆。模型A组于给药前第0周,及开始给药后第8、12周留取大鼠血浆。大鼠处死后,取出肝脏,肝组织一部分进行病理检查,剩余部分放入液氮。1.3肝匀浆的制备及蛋白浓度测定称取适量肝组织,加入9倍体积的匀浆介质,制成10%组织匀浆,离心取上清,用BCA法测定肝匀浆蛋白浓度。1.4血浆和肝匀浆中ALT、AST活性测定血浆和肝匀浆中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性参照试剂盒说明书通过酶标仪测定。1.5肝组织病理染色测定对照组和A、B模型组大鼠肝组织切片进行HE、masson染色,并根据Ishak评分系统对肝标本进行分级,并测定了masson染色后纤维化面积占比。1.6肝组织免疫组化测定通过免疫组化方法测定对照组和A、B模型组大鼠细胞增殖指数(Ki67)、增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)、胎盘型谷胱甘肽硫转移酶(Glutathione S-transferase placental form,GST-p)蛋白的表达水平和表达位置。2血浆ADH和肝匀浆ADH、ALDH活性测定ADH催化氧化型辅酶Ⅰ(NAD+)反应生成还原型辅酶I(NADH),NADH在340 nm处有吸收,通过测定340 nm处吸光度变化得到ADH活性,血浆和肝匀浆中ADH活性用此原理的试剂盒测定。ALDH催化NAD+反应生成NADH,测定340 nm处吸光度变化得到ALDH活性。肝匀浆中ALDH活性用此原理试剂盒测定。3统计方法采用SPSS17.0软件对各项数据资料进行统计学分析。两组间数据的比较采用独立样本t检验,三组及三组以上数据的比较用单因素方差分析,ADH、ALDH活性、ADH/ALDH与肝损伤相关指标间的相关性采用Person相关,检验水准α为0.05。结果1大鼠肝癌模型建立1.1大鼠体重肝重与对照组相比,模型组大鼠体重从诱模第2周到处死时均下降(P0.001)。和对照组相比,模型A组肝重无明显改变(P0.05),肝重/体重明显升高(P0.001);模型B组大鼠肝重升高(P0.001),肝重/体重升高(P0.001)。1.2大鼠存活情况模型组大鼠在诱导的前12周无死亡,在15-19周陆续死亡14只。1.3血浆和肝匀浆中ALT、AST活性与对照组相比,在8、12、16和19周模型组大鼠血浆中ALT、AST活性均有明显升高(P0.001)。与对照组相比,模型A组大鼠肝匀浆中ALT活性下降(P0.05),模型B组大鼠肝匀浆中ALT活性下降更明显(P0.01);与对照组相比,模型A组大鼠肝匀浆中AST活性升高(P0.05),模型B组大鼠肝匀浆中AST活性升高更明显(P0.01);与对照组相比,A、B模型组AST/ALT比值均升高(P0.001)。1.4病理染色结果和成癌率与对照组相比,A、B模型组大鼠肝组织Ishak评分和masson染色后纤维化所占面积均明显升高(P0.001)。模型A组(12周处死)大鼠均出现不同程度的肝纤维化。模型B组(19周处死)有5只大鼠出现肝腺瘤,9只出现肝细胞癌,成癌率为66.7%。1.5肝损伤相关指标的结果与对照组相比,A、B模型组大鼠肝脏切片中Ki67、PCNA阳性细胞率和GST-p平均光密度值均增加(P0.01)。与模型A组相比,模型B组Ki67和PCNA阳性细胞率下降(P0.01),GST-p平均光密度值无明显改变(P0.05)。2大鼠ADH、ALDH活性2.1大鼠血浆中ADH活性与对照组相比,模型组大鼠血浆中ADH活性在16周(24.21±9.86 U/ml)和19周(24.56±9.65 U/ml)升高(P0.05),在0、8、12周无明显改变(P0.05)。2.2大鼠肝匀浆中ADH、ALDH活性与对照组大鼠肝匀浆中ADH活性(3.43±1.07 U/mg prot)相比,大鼠肝匀浆ADH活性在模型A组(4.50±1.05 U/mg prot)、B(4.77±2.11 U/mg prot)组均升高(P0.05);对照组大鼠肝匀浆中ALDH活性为9.96±1.52 U/g prot,A、B模型组大鼠肝匀浆中ALDH活性分别为46.02±14.10 U/g prot和30.33±9.80U/g prot,较对照组显著升高(P0.001),与模型A组相比,模型B组大鼠肝匀浆中ALDH活性下降34.1%(P0.001)。3大鼠ADH、ALDH和肝脏损伤相关指标的关系3.1大鼠ADH基础活性和肝脏损伤相关指标的关系模型A组大鼠第0周血浆中ADH基础活性和12周测定的4个肝脏损伤相关指标有相关性(masson面积%,Ki67+%,PCNA+%,GST-p平均光密度值),相关系数分别为0.453、0.512、0.457、0.450(P0.05)。而模型B组大鼠血浆中ADH基础活性和19周测定的肝脏损伤相关指标不存在相关性(P0.05)。3.2大鼠肝匀浆中ADH、ALDH活性和和肝脏损伤相关指标的关系模型B组大鼠肝匀浆中ADH活性和19周测定的5个肝脏损伤相关指标(肝重/体重,结节数量,结节最大直径,结节累积直径,Ki67+%)有相关性,相关系数分别为0.567、0.499、0.438、0.626、0.506(P0.05)。模型B组肝匀浆中ADH/ALDH和19周测定的4个肝脏损伤相关指标(肝重/体重,结节数量,结节最大直径,结节累积直径)存在相关性,相关系数分别为0.720、0.476、0.522、0.755(P0.01)。结论1.模型组大鼠血浆中ADH活性在16周和19周较对照组升高,肝匀浆中ADH活性在12周和19周较对照组升高。2.12周和19周DEN诱导的肝癌模型大鼠肝匀浆中ALDH活性较对照组升高。3.大鼠血浆中ADH基础活性升高是肝纤维化的易感因素。
[Abstract]:Hepatocellular carcinoma (liver cancer) is the most common threat to human health of liver malignant tumor. Hepatitis cirrhosis hepatocellular carcinoma, the development model is supported. Liver fibrosis is the common pathological features of chronic liver disease, and chronic liver disease progression to cirrhosis stage. Alcohol dehydrogenase (alcohol dehydrogenases, ADH) and aldehyde dehydrogenase (aldehyde dehydrogenases, ALDH.ADH) mainly exists in the liver cells is mainly involved in the metabolism of ethanol, ethanol generated by the oxidation of acetaldehyde, acetaldehyde with liver toxicity, can induce cancer. At the same time, ADH is also involved in the metabolism of retinol, retinol and its metabolites in hepatitis and liver fibrosis, recent results show that ADH deficiency can inhibit liver fibrosis. According to reports, compared with the normal tissues adjacent to cancer. The activity of ADHI in liver cancer tissue increased. The activity of ADH in serum of patients with hepatocellular carcinoma compared with healthy individuals also increased. The room now During the results show that, compared with normal liver tissue, total ADH of hepatocellular carcinoma patients with liver fibrosis ADHI, ADHII activity were significantly increased, while the total ALDH and ALDH2 activity did not change. The results show that the increase of ADH activity and liver fibrosis or liver cancer may exist, but the activity of ADH in various stages of the development of HCC serum and the organization is how to change, increase the activity of ADH is the result of liver injury or cause the increase if there is further research on the susceptibility to liver injury. This study selected two diethylnitrosamine (diethylnitrosamine, DEN) of rat liver cancer model preparation as the research object, the determination of rats in different stage ADH activity induced by the correlation analysis of ADH based activity and liver injury related indicators in rat plasma, and analysis of liver tissue ADH, indicators of the correlation between ALDH activity and liver injury, in order to explore ADH 鍦ㄨ倽绾ょ淮鍖栫敋鑷宠倽鐧屽彂灞曚腑鎵，

本文编号：1589182