EZH2与VEGF在肾透明细胞癌中的作用及机制研究

发布时间：2018-03-10 22:07

  本文选题：肾透明细胞癌　切入点：EZH2　出处：《吉林大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：肾癌是泌尿系统中第三大肿瘤，全球范围内每年约有120,000例患者死于肾癌，并且有显著增加的趋势。肾细胞癌是成年人肾癌的最主要的类型，约占全部肾癌的90%，是肾癌发病率和死亡率主要的原因。 EZH2基因是PRC复合体中的核心成员，发挥组蛋白甲基化转移酶的作用，能够在组蛋白H3的27位赖氨酸上直接加入甲基，从而沉默基因的表达，包括肿瘤抑癌基因。EZH2基因表达失调与多种癌症的发生相关，但在肾癌特别是肾透明细胞癌中的研究很少。VEGF（Vascular endothelialgrowth factor）在肿瘤形成中血管生成中具有重要的作用，在肾癌中与肿瘤的生长、转移以及差的预后有关，并且抗VEGF在肾癌的治疗中已经被广泛应用，有研究表明EZH2和VEGF之间的表达具有调节作用，但是不同癌症中结果不一致，在肾癌中的调节作用还不是很清楚。为了研究这两个基因的病理特征和表达相关性，同时也为了更好的研究EZH2和VEGF基因在肾透明细胞癌中的作用和机制，我们收集了经病理诊断为肾透明细胞癌的患者肿瘤组织185例，10例正常肾组织作为对照，采用免疫组化芯片对EZH2和VEGF蛋白的表达进行检测，并结合患者的临床特征以及总生存期进行综合分析。为了研究EZH2和VEGF基因的功能，我们构建了EZH2基因的过表达质粒进行过表达实验，，同时合成了该基因的干扰片段进行敲减实验，选取786-O细胞株分别进行了增殖、凋亡和周期的相关的实验，取得如下结果： （1）EZH2和VEGF蛋白在肾透明细胞癌患者组织中的表达检测 为了检测EZH2和VEGF蛋白在肾透明细胞癌患者肿瘤组织中的表达情况，我们对185例肾透明细胞癌患者肿瘤组织和10例正常对照采用免疫组化新片的方法进行检测，芯片的结果显示，EZH2基因在癌旁对照中没有表达，而在肿瘤组织中出现表达，其中，低表达的患者有97例（97/185），高表达的患者有88例（88/185），主要表达在细胞核中，VEGF基因在癌旁和肿瘤中都有表达，在肿瘤组织中，低表达的患者有82例（82/185），高表达的患者有103例（103/185），主要表达在细胞质中。两者表达水平的相关性分析结果显示EZH2和VEGF蛋白表达水平呈显著的正相关（相关系数为0.850，P0.001）。 （2）EZH2和VEGF蛋白表达水平于临床特征以及生存期的相关性分析 为了分析EZH2和VEGF与肾透明细胞癌患者临床特征之间的相关性，我们收集了患者的年龄、性别、病理等级、TNM分期以及是否出现远处转移等信息，分别与EZH2和VEGF蛋白表达水平进行相关性分析；分析结果显示，两个基因的表达水平与TNM分期显著相关。EZH2低表达的患者Ⅰ-Ⅱ期有60例（60/97），Ⅲ-Ⅳ期的有37例（37/97）；EZH2高表达的患者Ⅰ-Ⅱ期有38例（38/88），Ⅲ-Ⅳ期的有50例（50/88），差异显著（P=0.013）。VEGF低表达的患者Ⅰ-Ⅱ期有32例（32/82），Ⅲ-Ⅳ期的有50例（50/82）；VEGF高表达的患者Ⅰ-Ⅱ期有66例（66/103），Ⅲ-Ⅳ期的有37例（37/103），差异显著（P=0.001）。EZH2和VEGF蛋白表达水平与远处转移也显著相关（EZH2和VEGF的显著性分布分别为P=0.011和P=0.038）。EZH2低表达的患者主要在低级别的肿瘤中（61%），而高表达的患者主要出现在高级别肿瘤中（57%）。EZH2和VEGF高表达主要分布在出现远处转移的患者中，EZH2和VEGF出现远处转移的比例分别为62%和67%。生存期分析中可以看出，EZH2低表达的患者平均总生存期为67.2个月，而高表达的患者平均总生存期仅为34.4个月，与低表达患者的平均总生存期相比，显著下降（P0.001）。 （3）下调EZH2的表达对肾癌细胞周期、凋亡、增殖以及对VEGF表达的影响 为了比较全面的探索EZH2基因在肾透明细胞癌中的作用，我们采用siRNA的方法在786-O细胞系中对EZH2基因的表达进行干扰，检测786-O细胞在周期、凋亡、增殖中的变化，同时检测下调EZH2基因的表达对VEGF表达的影响。干扰EZH2基因的表达后，无论从RNA水平还是蛋白水平都有显著的下降，并且可以显著的降低VEGF的表达。免疫荧光的结果显示，干扰EZH2的表达后，EZH2和VEGF的信号都大大降低，细胞增殖能力减弱。凋亡检测的实验中，干扰EZH2的表达可以显著的促进细胞的凋亡，Hoechst33258检测中2个干扰组的凋亡比例都增加了约2.5倍，在AnnexinV-PE的检测中凋亡细胞的比例从对照组的7.7%增加到25.9%和27.6%。细胞周期的检测结果显示干扰EZH2的表达，细胞周期出现了G1期阻滞，G1期的细胞比例从46.65%分别增加到70.65%和68.29%，G2期的细胞比例从17.30%降到4.31%和5.36%，S期细胞从36.05%降到25.04%和26.35%。 （4）上调EZH2的表达对肾癌细胞周期、凋亡、增殖以及对VEGF表达的影响 为了进一步探索EZH2的表达对肾癌细胞周期、凋亡、增殖以及对VEGF表达的影响，我们采用过表达的方法在肾癌细胞系786-O中上调EZH2的表达，分别检测了786-O细胞的周期、凋亡、增殖等生物学行为，同时检测了VEGF基因的表达。结果显示，上调EZH2的表达后，无论是RNA水平还是蛋白水平，EZH2和VEGF都显著的上调，免疫荧光的信号值也显著的增加，同时也可以发现EZH2蛋白主要在细胞核中表达，而VEGF蛋白主要在细胞质中表达，细胞增殖能力显著增加。凋亡检测的实验中发现，过表达EZH2的表达可以显著的降低凋亡细胞的比例，Hoechst33258检测中下降了约50%，在AnnexinV-PE的检测中凋亡细胞的比例从对照组的7.4%降低到3.4%。细胞周期检测的结果显示，过表达组中G1期细胞比例从52.71%降到31.46%，G2期细胞比例从16.62%增加到33.28%，S期的细胞比例从30.67%增加到35.26%。 本研究分别从肾透明细胞癌患者的肿瘤组织和肾癌细胞系对EZH2和VEGF在肾透明细胞癌中的作用机制进行研究，结果发现，EZH2基因的表达水平与VEGF的表达水平显著相关，EZH2基因可以显著的调节VEGF基因的表达，并且两者的表达水平与肾透明细胞癌患者的TNM分期、远处转移和生存期显著相关，具有差的预后。EZH2基因的表达水平可以影响肾癌细胞的增殖、凋亡和细胞周期，在肾癌的发生中具有重要的作用。本研究揭示EZH2基因在肾透明细胞癌中的作用机制，明确了与VEGF基因之间的调节关系，为肾癌的发生提供了一个新的视野，可能为肾癌治疗的提供一个重要的线索。
[Abstract]:Renal cell carcinoma is the third leading cause of cancer in the urinary system, about 120000 patients died of renal cancer worldwide, and there is a significant increase trend. Renal cell carcinoma is the main type of adult renal carcinoma, accounting for about 90% of all renal cell carcinoma, renal cell carcinoma is the morbidity and mortality of the main reasons.
EZH2 gene is a core member of the PRC complex, histone methyltransferase play the role, can be directly added in the 27 methyl lysines of histone H3, thus silencing gene expression, including tumor suppressor gene.EZH2 gene expression and the occurrence of many types of cancer related disorders, but especially in renal cell carcinoma clear cell renal cell carcinoma (Vascular endothelialgrowth factor) rarely.VEGF in tumor formation plays an important role in angiogenesis, tumor growth and metastasis in renal cell carcinoma, and poor prognosis, and anti VEGF has been widely used in the treatment of renal cell carcinoma, studies have shown that regulation of expression between EZH2 and VEGF with however, different cancer results are not consistent, regulatory role in renal cell carcinoma is not clear. In order to pathological features of these two genes and expression of the correlation, but also in order to better And Study on the mechanism of EZH2 and VEGF gene in renal clear cell carcinoma, we collected the tumor tissues of patients with pathologically diagnosed renal cell carcinoma in 185 cases, 10 cases of normal renal tissue as control group were detected by immune expression of EZH2 and VEGF protein chip, and combined with clinical features and overall survival were analyzed. In order to study the EZH2 and VEGF gene, we constructed the over expression of EZH2 gene plasmid expression experiments, and synthesis of the interference fragment of the gene by knockdown experiments, 786-O cell line was chosen respectively, proliferation, apoptosis and cycle of the related experimental results are as follows:
(1) expression of EZH2 and VEGF protein in the tissues of patients with renal clear cell carcinoma
In order to detect the expression of EZH2 and VEGF protein in renal cell cancer in the US in 185 cases of renal cell cancer and 10 normal controls by immunohistochemical method to detect the new chip, results show that the EZH2 gene had no expression on the photo in the adjacent, and appear in the tumor tissues, the low expression in 97 patients (97/185), high expression in 88 patients (88/185), mainly expressed in the nucleus, the VEGF gene is expressed in cancerous tissues and tumors, low expression in tumor tissue, 82 cases of patients (82/185), high the expression of 103 cases of patients (103/185), mainly expressed in the cytoplasm. The correlation analysis showed the expression level of the two was significantly correlated to the expression level of EZH2 protein and VEGF (r = 0.850, P0.001).
(2) correlation analysis of EZH2 and VEGF protein expression levels in clinical characteristics and survival period
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本文编号：1595277