消化系统新肿瘤标志物的初步探索与研究

发布时间：2018-03-12 15:15

本文选题：消化系统恶性肿瘤　切入点：lncRNA　出处：《山东大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景在全球范围内,恶性肿瘤是威胁人类生命健康的主要公共卫生问题之一。消化系统主要包括消化道和消化腺,所含器官众多,恶性肿瘤发病率也较高。其中肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)在世界范围内有着很高的发病率和死亡率,尤其是在中国,因为乙肝病毒的广泛流行,肝癌也是我国常见的恶性肿瘤,死亡率位居第二,HCC患者的数量大约占了全球患者数量的一半。另外结直肠癌(colorectal cancer,CRC)也是十分常见的消化道恶性肿瘤之一,在我国,其死亡率居恶性肿瘤第五位,发病率和死亡率也呈逐年上升趋势。目前,消化系统恶性肿瘤的发病机制尚未完全研究清楚,由于其不良预后和高死亡率,早期诊断、早期治疗就变得尤为重要。临床上消化系统恶性肿瘤早期诊断主要依赖于病理活检、影像学检查和血清学标志物等,但因具有侵入性或因敏感性、特异性不足,而无法满足临床的需求。寻找敏感性、特异性高的标志物用于消化系统恶性肿瘤早期诊断仍是临床亟待解决的问题。非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)通常是指不能翻译为蛋白的功能性RNA分子,包含短链ncRNA(如microRNA,piRNA,siRNA等),长链ncRNA(lncRNA)及环状RNA。lncRNA一般是指大于200nt的ncRNA,可在各种层面上调控基因表达,在细胞生长、发育、衰老、死亡等过程中均扮演关键角色。近些年研究发现,血液中存在大量且稳定的lncRNA,其表达谱同miRNA一样,也具有明显的组织和疾病特异性,即在不同组织、不同肿瘤中具有特异的表达谱,具有成为肿瘤早诊的血液学标志物的潜在价值。单一 lncRNA作为标志物的特异性和敏感性尚且较难满足临床需求,将差异表达的lncRNA组合建立肿瘤特异性表达谱,将改进单一标志物的低灵敏度、低特异性问题,成为早期诊断的有效手段。此外,肿瘤转移基因(Metastasis-Associated Protein,MTA)家族是一类重要的肿瘤转移相关基因,MTA3是其重要组成成员之一。到目前为止,有研究已发现MTA3在非小细胞肺癌中表达较正常肺组织升高;而在胃食管交界癌、乳腺癌及晚期子宫内膜腺癌中表达下降。其在肝癌和结直肠癌中尚未有研究,从既往的研究中可以推测,MTA3可能成为组织中的一种标志物。目的第一部分:1.用实时荧光定量的方法从82例肝细胞肝癌患者治疗前的血清中和74例健康者的血清中检测31种lncRNA的含量,并建立表达谱,利用lncRNA的表达量对肝癌进行诊断。2.从71例结直肠癌患者治疗前的血清中和70例健康者的血清中检测17种lncRNA的含量,并建立表达谱利用lncRNA的表达量对结直肠进行诊断。3.比较癌症患者术前术后血清lncRNA表达谱的变化,为监测肿瘤复发与进展提供依据。第二部分:1.采用含90对肝癌组织及对应癌旁组织标本的组织芯片检测MTA3蛋白的表达情况,以寻找预后指标与潜在治疗靶点。2.探究MTA3在肝细胞癌细胞中的生物作用。方法第一部分:1.用实时荧光定量的方法检测血清中lncRNA的含量。从选定的肿瘤相关的lncRNA中筛选出在肿瘤患者与健康者血清之间表达有差异的lncRNA。通过logistic回归分析建立lncRNA表达谱,用于区分癌症患者与健康者,通过受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,简称 ROC 曲线)下面积(area under ROC,简称AUC)检验模型的诊断效力。此外,将表达谱模型与传统肿瘤标志物结合,并检验结合后的诊断效力。2.比较患者术前术后血清中lncRNA表达谱水平的变化,以及lncRNA表达谱与临床参数之间的关系。第二部分:1.以购自上海芯超生物科技有限公司的肝细胞肝癌组织芯片为研究对象,芯片含有90对肝癌组织及对应癌旁组织标本。利用免疫组织化学技术检测组织芯片中MTA3蛋白表达水平,分析其表达状态与肝细胞肝癌患者临床特点以及预后的关系。2.从肝癌细胞系中研究MTA3的功能。通过干扰肝癌细胞中的MTA3表达,观察MTA3对肝癌细胞生物行为的影响。主要用到的实验方法包括:细胞培养、siRNA干扰、western blot、克隆形成、transwell、划痕实验等。结果第一部分:1.在肝癌患者血清中,被检测的31种lncRNA,有25种表达,其中7种表达有统计学差异(p0.05)。2.用多元logistic逐步回归的统计学方法发现,PVT1和uc002mbe.2二者结合诊断肝癌的AUC为0.764(95%CI:0.684-0.833)。十折交叉验证AUC为0.744(95%CI:0.662-0.815)。乙肝病毒感染的肝癌患者AUC为0.742(95%CI:0.652-0.818);乙肝病毒感染阴性的患者,AUC 为 0.795(95%CI:0.692-0.876)。3.PVT1和uc002mbe.2组合与肝细胞肝癌传统标志物AFP相结合时,无论AFP界值取20μg/L,20μg/L,400μg/L还是80μg/L,结合之后的诊断效力都显著高于AFP单独诊断的诊断效力(p0.01)。4.PVT1和uc002mbe.2组合表达水平与肝细胞肝癌肿瘤的大小、巴塞罗那分期以及血清胆红素水平相关(P0.05);与年龄、性别、饮酒史、血清AFP水平、乙肝病毒感染状态、微血管侵犯情况、大血管侵犯情况、淋巴转移、门脉高压及血清白蛋白水平无明显相关(p0.05)。5.肝癌患者术后较术前血清中PVT]和uc002mbe.2组合表达水平明显下降(p =0.011)。6.在结直肠癌患者血清中,被检测的17种lncRNA,有13种表达,其中5种表达有统计学差异(p0.05)。7.用多元logistic逐步回归的统计学方法发现,LOC285194,RPl1-462C24.1和Nblal2061三者结合诊断结直肠癌的AUC为0.793(95%CI:0.709-0.861,灵敏度为68.33%,特异度为86.89%)。其诊断效力要显著高于传统的结直肠癌标志物:CEA(0.633;95%CI:0.541-0.719),CA199(0.567;95%CI:0.474-0.656),CA125(0.517;95%CI:0.424-0.608)和 CA724(0.592;95%CI:0.499-0.680)。8.3 种 lncRNA 组合(LOC285194,RP11-462C24.1 和 Nblal2061)与传统血清标志物相结合,其结直肠癌诊断效力会更高。除了与CA125结合无明显统计学差异外(p0.05),与CEA、CA199、CA724结合都与比组合本身效力要高。其结合后的AUC分别为0.845(与CEA结合),0.855(与CA199结合),0.798(与CA125结合)和0.824(与CA724结合)。9.结直肠癌患者术后3-lncRNA组合表达量低于术前(p0.01)。第二部分:1.在肝细胞肝癌组织标本中,大于90%的样本表现为MTA3的核表达。癌旁组织仅有33.75%的核表达。41%的癌组织胞浆中MTA3表达,93.75%的癌旁组织胞浆中MTA3表达。MTA3在肝细胞肝癌组织中的细胞核中表达较癌旁组织显著升高(p0.05)。2.癌组织中胞核MTA3的表达水平与肿瘤的转移程正相关(p= 0.010)。癌组织中胞核MTA3表达升高,患者总体生存率(OS)显著缩短(log-rank检验,p0.05)。Cox回归多因素分析提示癌组织胞核中MTA3的高表达是影响预后的独立不良因素,HR为2.3(p= 0.035)。3.在被检测的 6 种肝癌细胞系(QGY7701,QGY7703,BEL7404,HepG2,Huh7及BEL7402)中,MTA3在BEL7402中表达较高。通过siRNA干扰后,MTA3表达下调。随后的克隆形成、transwell及划痕实验显示,MTA3下调后BEL7402细胞的增殖、侵袭及转移力下降。结论1.血清中2-lncRNA(PVT1和uc002mbe.2)组合为肝细胞肝癌的诊断提供了一种新的补充方法;3-lncRNA(LOC285194,RP11-462C24.1 和 Nblal2061)组合为结直肠癌的诊断提供了新的方法。可以提高传统标志物的诊断效力,以及帮助监测治疗与复发。2.MTA3在肝细胞肝癌中的胞核中表达上调,其表上调与临床转移相关,与不良预后相关。有作为提示预后的肿瘤标志物的可能。3.在体外实验中,MTA3有促进肝癌细胞增殖、侵袭和转移的作用。可能成为一种治疗的靶点。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735

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