miR-144通过靶向TIGAR对肺癌细胞生长、侵袭和自噬的影响

发布时间：2018-03-12 23:04

本文选题：miR-144　切入点：肺癌　出处：《郑州大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景和目的原发性肺癌是目前世界上死亡率最高的肿瘤性疾病,按组织学分类可分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)两大类,后者的比例占到80%。肺癌预后不良,其5年生存率仅约为15%。近年来靶向治疗成为肺癌研究最多的新的治疗方案,因此进一步研究肺癌的发生及发展、侵袭机制,探索新的基因治疗靶点以用于肺癌的早期诊断和个体化治疗,对攻克肺癌目前高死亡率的难题有着深远的意义。miRNAs通常是18~22nt长的、内源性、并且不编码的RNA,它能够与其靶基因的mRNA发生特异性结合从而影响其转录和翻译功能。在人类等哺乳动物当中,miRNAs参与调控大约50%以上的基因蛋白的编码活动。miRNAs通常作用于mRNA 3’端和5’的非翻译区(3’UTR区,5’UTR区),通过与靶基因的seed region之间的结合与作用进而发挥其调控功能。目前多数研究表明miRNAs参与各种生物过程的调控,并在其中起到非常重要的作用,其中包括衰老和一些疾病如恶性肿瘤等等的发展。miR-144最早被认定为是由成熟的红细胞系分化得来的。除此以外,miR-144可以通过直接调节细胞应对氧化应激反应的中枢调节器官增加贫血的程度以及减少谷胱甘肽再生和抗氧化能力。在肿瘤研究中,一个关于miRNAs的表达的微阵列数据的meta分析提示:miR-144在肝癌细胞、肺癌和前列腺癌中呈低表达状态。另有研究结果提示,上调miR-144的表达可促进宫颈癌细胞的增殖。以上结果均表明,miR-144可能是一个与人癌症相关的一个miRNA。但是,对于miR-144高表达在肺癌中的作用机制尚不明确,需要进一步研究和探讨。本研究计划包含以下三部分:第一部分:肺癌组织中miR-144和TIGAR的表达情况及与肺癌患者临床特征之间的相关性分析;第二部分:上调miR-144表达对肺癌H460和A549细胞株多种生物学的影响;第三部分:分析miR-144对TIGAR的初步调控机制。第一部分肺癌组织中miR-144和TIGAR表达水平及与患者临床特征间的相关性的分析方法1.标本收集:67例术后切除的肺癌及相应癌旁组织标本。2.qRT-PCR技术用来检测67例标本中miR-144和TIGAR mRNA相对表达水平。3.Western-blot检测各样本中TIGAR蛋白相对表达量。4.分析miR-144和TIGAR mRNA的表达水平与肺癌患者的年龄、性别、吸烟与否、肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移情况、TNM分期之间的相关性。5.应用SPSS 17.0软件进行统计学分析,符合正态分布的数据以(x±s)表示;单因素方差分析用于同时具备正态性及方差齐性数据的多项指标间的比较,LSD-t检验用于多组数据的两两比较;t检验用于两独立样本计量资料的比较,配对t检验用于两配对样本计量资料的比较;Pearson相关分析用来分析两变量之间的相关性,设定检验水准α=0.05。结果1.qRT-PCR检测显示miR-144的相对表达水平在肺癌组织中较癌旁组织显著降低(P0.05),且和TIGAR mRNA的相对表达水平呈负相关(R2=0.6627)。2.肺癌组织中miR-144的相对表达水平与患者的肿瘤大小、TNM分期以及淋巴结转移情况相关(P0.05)。第二部分上调miR-144表达对肺癌H460和A549细胞株生物学行为的影响方法1.制备、包装p GV-miR-144慢病毒载体。2.慢病毒载体感染H460和A549细胞株,筛选出可以稳定表达的细胞株,运用qRT-PCR检测慢病毒感染后H460和A549细胞中miR-144表达。3.按miR-144、miR-NC感染情况分别将实验细胞分为miR-144组,Scramble组和Blank组。4.CCK-8、克隆形成实验用来检测细胞的增殖能力。5.流式细胞术、Caspase-3/7、Hoechst染色检测各组细胞凋亡能力。6.MDC染色检测各组细胞的自噬能力。7.裸鼠移植瘤实验检测上调miR-144的表达对肺癌A549裸鼠成瘤能力的影响。结果1.成功制备及包装miR-144慢病毒载体,miR-144在感染的H460和A549细胞内的相对表达量较Scramble组和Blank组显著升高(P0.05)。2.CCK-8结果显示miR-144组细胞吸光度较Scramble组和Blank组显著减少。克隆形成实验结果显示miR-144组较Scramble组和Blank组的细胞克隆形成数显著降低,差异具有显著性(P0.05)。3.流式细胞术和Hoechst染色检测结果显示miR-144组细胞凋亡百分比较Scramble组和Blank组显著升高,miR-144组Caspase-3/7细胞活性较Scramble组和Blank组显著升高,差异具有显著性(P0.05)。4.MDC染色结果显示miR-144组的细胞荧光强度较Scramble组和Blank组显著升高(P0.05)。5.裸鼠移植瘤实验结果表明miR-144组的成瘤能力显著低于Scramble组和Blank组(P0.05)。第三部分miR-144对TIGAR表达调控机制的初步研究方法1.运用miRNA的靶基因预测数据库对miR-144的靶基因进行预测。2.构建pmir GLO-w-TIGAR、pmir GLO-mut-TIGAR重组载体。运用双报告基因验证miR-144的靶基因。3.构建无3’UTR区的pc DNA3.1-TIGAR表达载体,回复实验分析miR-144对A549细胞生物学作用的调控。4.设计并合成siRNA序列可靶向作用于TIGAR,并分si-TIGAR组、miR-144组、Blank组转染至A549细胞。运用CCK-8法和克隆形成实验检测各组细胞增殖能力,流式细胞术检测各组细胞的凋亡能力,MDC染色检测各组细胞的自噬能力,Western blotting检测自噬相关蛋白的表达水平。结果1.生物信息学软件分析预测miR-144的靶基因可能为TIGAR2.双报告基因结果表明,miR-144可以结合于TIGAR的3'UTR区发挥调控作用。3.miR-144对A549细胞的抑制增殖及促进凋亡的能力可被转染不含3’UTR区的pc DNA3.1-TIGAR重组载体后的A549细胞回复。4.A549细胞miR-144的表达上调及TIGAR表达下调均可抑制A549细胞的增殖、促进其凋亡和自噬能力。结论1.miR-144在肺癌组织中的表达水平降低,且其表达水平与患者的肿瘤大小、有无淋巴结转移以及TNM分期有关。2.体外上调肺癌细胞中miR-144表达可抑制细胞的增殖能力,促进细胞的凋亡和自噬能力。裸鼠移植瘤实验表明上调miR-144的表达能有效抑制肺癌细胞的成瘤能力。3.miR-144可作用于TIGAR的3’UTR区负向调控其表达,从而抑制肺癌细胞的生长、促进细胞的凋亡和自噬,还能有效抑制肺癌细胞的成瘤能力。
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【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2

【参考文献】