骨髓间充质干细胞通过细胞融合促进胶质瘤血管生成的实验研究

发布时间：2018-03-16 07:01

  本文选题：胶质瘤　切入点：肿瘤血管生成　出处：《苏州大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分胶质瘤细胞与骨髓间充质干细胞体外融合实验背景与目的:骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)因具有自我更新、多向分化的潜力,一直受到学者们的关注。最近发现BMSCs可以被招募到胶质瘤微环境中,通过直接或间接作用对肿瘤的发生、发展产生重要作用。但胶质瘤细胞和骨髓间充质干细胞是否可以通过细胞融合发挥生物学效应尚不明确。本部分拟研究体外共培养体系中的胶质瘤细胞与骨髓间充质干细胞,观察两者是否可以发生体外融合,及融合后细胞的生物学变化。方法:构建表达红色荧光蛋白(RFP)的胶质瘤细胞SU3-RFP,同时获取转染绿色荧光蛋白(GFP)基因裸小鼠的骨髓间充质干细胞BMSCs,将SU3-RFP与BMSCs体外共培养,荧光显微镜下动态观察,用流式细胞分选技术筛选出RFP+/GFP+细胞,对其进行分子标记物的鉴定,CCK-8法、软琼脂糖克隆形成实验、划痕实验等分析融合细胞的增殖、迁移能力,皮下致瘤实验比较融合细胞和亲本胶质瘤细胞的致瘤能力。结果:获取的BMSCs稳定表达绿色荧光蛋白,高表达CD105、CD90、CD44,基本不表达CD45、CD11b,并具有成骨、成脂肪分化能力。SU3-RFP和BMSCs共培养后在荧光显微镜下观察到RFP+/GFP+细胞,经活细胞工作站可以观测到细胞融合的过程。单克隆RFP+/GFP+细胞,经RT-PCR及Western Blot鉴定其表达RFP、GFP、CD105、Nestin。体外生物学研究显示融合细胞增殖速度快于SU3-RFP,克隆形成能力及迁移能力强于SU3-RFP。将融合细胞及SU3-RFP接种BALB/C裸鼠皮下,均致瘤(5/5),融合细胞移植瘤体积为779.6±177.78 mm2,重量为0.62±0.14g;SU3-RFP移植瘤的体积为414.01±105.04mm2,重量为0.33±0.08g。结论:胶质瘤细胞SU3-RFP能与BMSCs在体外发生自发融合,融合细胞同时表达亲本细胞的特征性基因和蛋白,且与亲本胶质瘤细胞相比恶性度更高。第二部分融合细胞体内、体外成血管实验研究背景与目的:肿瘤血管生成对肿瘤的生长至关重要,胶质瘤内丰富的血供、活跃的血管新生也是胶质瘤恶性表现之一。本部分拟通过体外、体内实验研究融合细胞是否具有成血管能力,并通过检测融合细胞与亲本胶质瘤细胞的干性基因表达差异,探寻可能的机制。方法:将三组细胞培养于Matrigel上,动态观察细胞的形态、结构的变化。同时将三组细胞培养于内皮细胞分化培养基内,并以培养在普通条件下的三组细胞作为对照,24小时后,通过RT-PCR、Western Blot、免疫细胞化学染色法检测内皮细胞标志物CD31、CD34、VE-Cadherin的表达。通过SU3-RFP及融合细胞裸鼠颅内原位致瘤,比较移植瘤的微血管密度,检测体内血管生成能力。用流式细胞术分析融合细胞和SU3-RFP细胞中CD133+细胞的比例,用RT-PCR检测干性基因Nanog、Oct-4、Sox2的表达,验证三株细胞的干性基因表达差异。结果:培养在Matrigel上的融合细胞逐渐形成管状结构,在内皮分化条件刺激下,多种血管内皮细胞的标志分子(CD31、CD 34、VE-Cadherin)在转录及翻译水平显著上调。融合细胞和SU3-RFP裸小鼠原位移植均具有致瘤性,CD31免疫组织化学染色计算微血管密度(MVD),在融合细胞移植瘤为19.67±1.8/视野,SU3-RFP移植瘤为7.16±0.54/视野,融合细胞组明显高于SU3-RFP组。检测融合细胞和亲代胶质瘤细胞干性标记物表达发现,融合细胞中CD133+细胞比例、Nanog、Oct-4、Sox2表达水平均高于SU3-RFP。结论:融合细胞与亲本胶质瘤细胞相比,体内、体外成血管能力均增强,可能与细胞融合后干性基因表达增强有关。第三部分利用双色荧光示踪裸小鼠移植瘤模型研究胶质瘤血管生成中的细胞融合作用背景与目的:研究体内肿瘤血管生成过程需要良好的示踪模型,以显示肿瘤细胞和宿主的相关作用关系。本部分拟采用双色荧光示踪的肿瘤模型,分析移植瘤中的血管结构,寻找融合细胞参与肿瘤血管生成的证据。方法:将胶质瘤细胞株SU3-RFP细胞,接种于表达绿色荧光蛋白(GFP)的NC-C57Bl/6J-GFP裸鼠右侧尾状核,接种后4周,一部分移植瘤做切片观察,一部分做原代培养。部分移植瘤组织采用厚切片压片法观察,部分移植瘤组织用OCT包埋后做5μm连续冰冻切片在荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜下观察。荷瘤鼠无菌条件下完整取出肿瘤,消化后获取原代细胞,流式细胞术检测RFP+细胞、GFP+细胞、RFP+/GFP+细胞所占的比例。结果:荧光显微镜下可以区分表达RFP的肿瘤细胞和表达GFP的宿主细胞。组织压片在荧光显微镜下观察到共表达RFP和GFP的管腔样结构,提示存在肿瘤细胞与宿主细胞融合产生的黄色血管。激光共聚焦显微镜下观察肿瘤组织冰冻切片,发现血管壁上存在RFP+/GFP+细胞,因相邻切片的相邻位置细胞同时表达CD105、CD90,我们推测这些RFP+/GFP+/CD105+/CD90+细胞由肿瘤细胞和宿主骨髓间充质干细胞融合而来。结论:双色荧光蛋白示踪的可移植性胶质瘤模型,可清晰显示肿瘤组织中的宿主血管、肿瘤血管和肿瘤细胞与宿主细胞共建的血管,从而证实了细胞融合是肿瘤血管生成的重要途径。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41

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本文编号：1618812