GLUT1介导EF-24抑制非小细胞肺癌细胞生长的机制研究

发布时间：2018-03-16 11:22

本文选题：联苯二氟酮　切入点：葡萄糖转运蛋白1　出处：《山东大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景肺癌(lung cancer)是一种严重危害人类生命健康的主要恶性肿瘤,在全球范围内其死亡率位列恶性肿瘤首位,并且近年来其发病率及死亡率呈逐年上升趋势。肺癌中以非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)居多,占80%-85%,治疗的手段主要是手术、放疗、化疗和分子靶向治疗为主的综合治疗。NSCLC的病因尚未明确,发病机制复杂,是多种因素共同作用的结果,已有研究表明空气污染、吸烟等环境因素以及遗传因素与其发病有关。近年来,国内外学者从不同角度探讨NSCLC的发生发展机制,发现非小细胞肺癌的癌细胞增殖能力增强,这一点与正常细胞不同,而这一特性的获得与癌细胞对葡萄糖的摄取以及糖酵解代谢的增强有关。葡萄糖摄取量的增加和糖酵解能量代谢的增强不仅可导致肿瘤细胞的恶性转化、浸润和转移,而且还造成后期对放疗、化疗等治疗方法的抵抗,所以传统的肿瘤治疗方式很难达到理想的效果。葡萄糖转运蛋白(glucose transport protein, GLUT)是嵌入在细胞膜上,转运葡萄糖的载体蛋白,在正常生理条件下葡萄糖需借助GLUT而被细胞所摄取。该家族的主要成员葡萄糖转运蛋白1 (glucose transporter protein 1, GLUT1)是细胞糖代谢的主要限速蛋白,是体内分布最广的葡萄糖转运蛋白,几乎在所有的肿瘤组织中均存在过度表达。GLUT1的过度表达使肿瘤细胞在缺血、缺氧的情况下得以高效摄取和利用葡萄糖,从而获得更多的能量供应,以维持肿瘤细胞快速生长。研究表明NSCLC细胞的恶性增殖和侵袭转移性能与GLUT1的过度表达密切相关,而且与肿瘤的大小、分化程度、转移呈正相关。姜黄素(curcumin)是从姜黄属植物姜黄、郁金、莪术等的根或茎中提取的一种有效植物多酚,它具有抗菌、抗病毒、抗氧化和抗炎症反应的多重生物学效应。2004年Adams等人在姜黄素分子结构的基础上,发现了一百多种姜黄素衍生物,它们大部分都具有抗肿瘤的作用机制,其中联苯二氟酮(Diphenyl difluoroketone, EF-24)的作用最为显著。研究发现EF-24对大多数恶性肿瘤细胞株,与胃癌、肠癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌及卵巢癌等相关,都有明显的抑制作用,其效果至少是姜黄素的10余倍。EF-24在治疗前列腺癌和乳腺癌时可以直接抑制低氧诱导因子-1α (hypoxia induce factor-1 a, HIF-1α)的转录活性,从而使肿瘤细胞中HIF-1 a介导的调节葡萄糖转运蛋白和糖酵解酶的相关基因上调,促使肿瘤在低氧时采用糖酵解途径。并且EF-24在卵巢癌细胞研究中可以抑制GLUT1介导的代谢,从而抑制肿瘤侵袭、转移。鉴于此,我们设想以GLUT1为切入点,利用Western-blotting、RT-PCR检测EF-24对非小细胞肺癌细胞GLUT1蛋白及基因的影响；观察EF-24在不同浓度对非小细胞肺癌细胞增殖活性的影响；利用Trans well细胞侵袭实验以及建立裸鼠皮下移植瘤的动物模型,通过体内和体外实验观察EF-24对非小细胞肺癌细胞侵袭和转移能力的影响；通过观察EF-24在细胞水平、机体水平对非小细胞肺癌细胞转移和增殖活性以及糖酵解中糖代谢和GLUT1表达的影响,研究EF-24与非小细胞肺癌细胞的增殖、转移的关系,为有效防治非小细胞肺癌提供药物治疗的新靶点。目的：1.明确NSCLC患者的肺部癌组织、癌旁组织以及正常肺组织中GLUT1的转录水平以及翻译水平的表达情况；2.以GLUT1为切入点,不同浓度的EF-24处理NSCLC细胞系A549细胞,通过MMT实验明确EF-24对A549细胞增殖活性的影响；3.研究EF-24与NSCLC的侵袭、转移的关系,为有效防治肺癌提供药物治疗新靶点。方法：1.收集NSCLC患者的临床新鲜手术组织标本,如正常组织标本、成对肺癌组织、癌旁组织。所取临床标本经山东大学第二医院伦理委员会审计批准。2.应用蛋白印迹实验、免疫组化的方法来明确NSCLC组织结构中GLUT1的表达情况,并结合临床病理结果分析GLUT1的表达与NSCLC临床病理分级的关系。3.利用不同浓度的EF-24处理NSCLC A549细胞系,应用RT-PCR、免疫印迹、荧光报告分析等实验来明确GLUT1在转录和翻译水平的表达情况,并结合细胞周期分析、细胞迁移实验、体内成瘤实验、MTT法测定细胞增殖活性等方法进一步评估此现象。4.应用细胞转染技术、细胞计数、检测细胞增殖实验的方法,通过细胞体外、裸鼠体内2种实验来分析GLUT1对A549细胞系的生长增殖能力的影响。5.统计学分析：实验数据应用统计软件SPSS16.0进行分析统计。符合正态分布的数值变量资料应用均数±标准差表示(x±s)。两组之间的统计学比较应用t-test,多组之间等级资料的统计学比较采用方差分析、Tukey检验。P值0.05被认为具有统计学差异。结果：1.在患者肺组织标本中,通过RT-PCR、免疫印迹技术,我们发现与对应的癌旁组织、正常肺组织比较,肺肿瘤组织中GULT1的表达在转录及翻译水平均明显上调,并与肿瘤的临床病理分级呈正相关关系。2.本研究通过在A549细胞系中转染GLUT1 siRNA及shRNA将GLUT1基因沉默,并经细胞计数、检测细胞的增殖实验方法,证实了GLUT1基因的沉默能够引起A549细胞的生长和增殖能力减低。另外,通过在裸鼠的体内实验,A549细胞被转染GLUT1 shRNA注射入裸鼠体内,7周后发现与对照组比较,肿瘤的体积明显缩小,这进一步证实沉默GLUT1基因可以显著抑制肺癌细胞的生长。因此,我们认为GLUT1被沉默后A549细胞的生长和成瘤能力均受到显著抑制,从而反向证明了GLUT1促进A549细胞系的生长增殖能力。3.利用不同浓度EF-24处理A549细胞,通过免疫印迹技术,结果表明在A549细胞中的EF-24可以显著减少GLUT1的表达,并且这种下降呈明显的梯度依赖性,与EF-24的药物浓度成正比。4.通过采用不同浓度的EF-24分别处理A549细胞,检测A549细胞中葡萄糖的吸收和糖酵解的速度、观察Transwell细胞迁移、侵袭及用MTT检测细胞增殖能力,我们发现EF-24可以抑制A549细胞的糖酵解途径及抑制A549细胞的迁移和侵袭。结论：1.本实验发现GLUT1在非小细胞肺癌组织的表达显著高于相邻癌旁组织和正常的肺组织；2.本研究证明EF-24可以抑制GLUT1基因在A549细胞系的表达,从而影响NSCLC细胞系A549细胞的糖酵解途径及迁移侵袭,进而抑制NSCLC的生长；3.姜黄素类似物EF-24为肺癌的药物治疗提供了一个新的选择。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2

【相似文献】