JunD在宫颈癌进展中的功能及其分子机制研究

发布时间：2018-03-17 08:46

  本文选题：JunD　切入点：官颈癌　出处：《浙江大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：宫颈癌是全球女性第四大常见恶性肿瘤,也是全球女性排名第四的死亡原因。虽然随着筛查的大规模开展,手术及放化疗的长足进展,宫颈癌的发生率和死亡率有一定下降,但中晚期宫颈癌患者的预后仍然不尽如人意,寻找中晚期宫颈癌有效的治疗方法对改善该类患者的预后意义重大。高危人乳头瘤病毒(High Risk Human papillomavirus, HR-HPV)持续感染是宫颈癌发生与进展的必要因素。病毒癌基因通过影响宿主细胞的相关分子来扩大自身癌基因的恶性效应,探索宿主细胞中受病毒影响的相关分子,是临床研究中寻找潜在治疗靶标的重点。JunD蛋白是由JUND基因编码,最晚加入Jun家族的成员,其表达方式及生物学功能与家族其它成员并不相同。JunD激活或抑制各种不同的靶基因介导细胞增殖、凋亡和分化等功能。在肿瘤细胞中,JunD蛋白的表达紊乱、对JunD的调控异常及与其它因子如MEN1、cyclinD、p21、MMP-7等的相互作用,参与肿瘤的形成、转移、血管生成等过程。为了明确JunD在宫颈癌进展中的功能及分子机制,本研究首先利用细胞功能实验探索JunD在宫颈癌中对细胞生物学行为的影响,再通过生物信息学方法寻找靶基因,通过基因功能实验验证及确定其发挥作用的靶基因,明确靶基因在宫颈癌中的功能,最后利用宫颈相关组织样本验证JunD及靶基因的组织相关性,并比较分析JunD与靶基因的表达水平与宫颈不良预后病理参数的相关性。旨在寻找官颈癌潜在的治疗靶点,为探索中晚期宫颈癌的治疗新策略提供证据。第一部分JunD对宫颈癌细胞生物学行为的影响目的：明确JunD对宫颈癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移等生物学行为的调控作用。方法：采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time RT-PCR,qRT-PCR)法和vestern blot检测JunD在HPV阳性的宫颈癌细胞系和HPV阴性的细胞系的mRNA和蛋白水平。利用细胞转染技术分别在宫颈癌细胞株SiHa和CaSki中转染JunD小干扰序列或阴性对照下调JunD的表达,在HPV阴性细胞株U20S中转染JunD表达质粒或空载质粒上调JunD的表达,分别通过CCK-8法检测肿瘤细胞的增殖能力、流式细胞技术检测细胞凋亡、Transwell联合或不联合matrigel实验检测细胞的侵袭和迁移能力。结果：1. JunD在HPV阳性宫颈癌细胞株中的表达水平高于在HPV阴性细胞株的表达。2.宫颈癌细胞株SiHa和CaSki中干扰JunD的表达能抑制肿瘤细胞的增殖能力,促进细胞早期凋亡,同时细胞的迁移和侵袭能力均受到明显抑制。3.HPV阴性细胞株U20S中上调JunD的表达促进细胞增殖,抑制细胞早期凋亡,促进细胞侵袭和迁移。结论：1.在宫颈癌细胞中,JunD的表达促进细胞增殖、抑制凋亡、促进细胞的侵袭和迁移,提示JunD在宫颈癌进展过程中发挥促癌作用。第二部分JunD基因的生物信息学分析及靶基因的验证目的：寻找JunD发挥功能的靶基因,以揭示JunD参与宫颈癌进展的作用和分子机制。方法：对Oncomine数据库内临床样本数据集和细胞系数据集,进行共表达分析筛选可能存在的与JunD共表达的基因。结合BioGRID数据库筛选可能存在的与JunD有蛋白相互作用关系的共表达分子。利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time RT-PCR, qRT-PCR)法对筛选得到的靶分子在HPV阳性的宫颈癌细胞系和HPV阴性的细胞系检测mRNA水平。利用小干扰技术调控JunD的表达,观察靶分子的mRNA和蛋白水平的改变,利用免疫共沉淀技术检测JunD与靶分子的关系。结果：1.通过Oncomine数据库和BioGRID数据库预测得到与JunD存在蛋白互作关系并在官颈癌中共表达的分子。2.在HPV阳性的宫颈癌细胞系和HPV阴性的细胞系检测部分筛选得到的分子,预测得到靶分子SIRT1。3. JunD能与SIRT1结合并同向调控SIRT1的蛋白表达。结论：1. Oncomine数据库是筛选功能相关目的基因的有效工具。2. SIRT1受JunD转录后水平的调控,是JunD的直接靶基因。第三部分SIRT1对宫颈癌细胞生物学行为的影响目的：验证靶基因SIRT1在宫颈癌中对细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移等生物学行为的影响。方法：利用细胞转染技术在宫颈癌细胞株SiHa中转染SIRT1小干扰序列或阴性对照序列下调SIRT1的表达,分别通过CCK-8法检测肿瘤细胞的增殖能力、流式细胞技术检测细胞凋亡、Transwell联合或不联合matrigel实验检测细胞的侵袭和迁移能力。实时荧光定量PCR(quantitative real-time RT-PCR,qRT-PCR)法和western blot法检测SIRT1的mRNA和蛋白水平。结果：1.在宫颈癌细胞株中,干扰SIRT1的表达可抑制SiHa细胞的增殖,促进细胞早期凋亡、并抑制细胞的侵袭和迁移能力。结论：1. SIRT1高表达促进宫颈癌细胞的增殖、侵袭和迁移,并抑制凋亡,提示SIRT1在宫颈癌进展过程中发挥与JunD类似的促癌作用。第四部分JunD与SIRT1在官颈组织中的表达及意义目的：观察JunD和SIRT1在宫颈组织中的表达差异及与临床不良预后因素间的相关性。方法：采用免疫组织化学的方法检测59例正常官颈上皮组织标本、77例宫颈高级别病变、138例宫颈鳞癌组织中JunD和SIRT1的表达水平,根据收集的病例的临床相关资料整理其病理信息,分析JunD和SIRT1的表达水平与宫颈癌临床不良预后病理因素的相关性。结果：1. JunD和SIRT1在宫颈鳞癌中的表达水平高于高级别病变组和正常上皮组织组。2. JunD高表达与FIGO分期、细胞分化程度、脉管浸润、间质浸润呈显著正相关。3. SIRT1高表达与FIGO分期、细胞分化程度、脉管浸润呈显著正相关。4. JunD高表达与SIRT1高表达显著相关。结论：1. JunD翱SIRT1在宫颈癌组织中显著相关,并且其高表达与官颈癌不良预后因素相关,提示JunD和SIRT1可能具有用于预测宫颈癌预后的潜在价值。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.33

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本文编号：1624006