RNA干扰介导非小细胞肺癌ADAM9和Stat3基因沉默的研究

发布时间：2018-03-19 19:32

  本文选题：非小细胞肺癌　切入点：ADAM9　出处：《吉林大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景:肺癌是目前发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,且发病率呈持续增长趋势,严重威胁人类健康,其中以非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)流行最广,约占肺癌总数的80%,其发病和致死的主要原因是癌细胞转移,但目前对NSCLC转移机制尚不清楚,使得对NSCLC的预防和治疗更加困难。目前对NSCLC的治疗主要采用手术、放疗和化疗,但多数患者确诊时已是晚期,失去了手术治疗的最佳时机而以化疗为主。化疗虽然能改善晚期NSCLC患者生存期限,但由于其没有细胞选择性,对正常细胞的杀伤同样严重,会导致患者免疫力下降并产生严重并发症。因此,研究潜在NSCLC治疗靶点和治疗策略迫在眉睫。近几年对分子靶向治疗的研究日益深入,并逐渐应用于癌症的临床治疗,取得了较好的疗效,为NSCLC的治疗提供了新的方向。去整合素和金属蛋白酶家族(A disintegrin and metalloproteinases,ADAMs)是一类锌依赖性I型跨膜蛋白,具有蛋白水解酶活性和细胞粘附功能,能水解多种蛋白的胞外功能区,使之脱落,从而参与调节相关信号转导途径。此外,ADAMs还参与降解胞外基质、细胞间及细胞与基质间粘连、细胞融合等过程,并在精卵结合、伤口愈合及肿瘤发生和转移等病理生理过程中发挥重要作用。ADAM9作为ADAMs家族重要成员,可高表达于多种癌变组织和细胞中,并参与肿瘤的发生发展和转移过程。研究发现,ADAM9显著表达于NSCLC患者中,并可导致患者生存期缩短;ADAM9过表达可增加NSCLC细胞粘附和侵袭能力;通过RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术使ADAM9基因沉默可抑制腺样囊性癌细胞生长和转移;RNAi介导ADAM9基因沉默可抑制A549细胞增殖、迁移和侵袭,诱导细胞凋亡。研究表明,ADAM9参与表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)配体外功能区酶解脱落及裂解Delta-likel等过程。以上研究结果揭示,ADAM9可作为NSCLC治疗的潜在靶点。信号转导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription,Stat3)是STAT家族重要成员,多种细胞因子、生长因子均可激活Stat3,并参与相关信号转导。研究发现,Stat3活化后可参与调节细胞生长、凋亡及细胞周期等;Stat3参与多个癌症相关的酪氨酸激酶信号途径,并高表达于多种肿瘤组织和细胞中,如前列腺癌、乳腺癌、NSCLC和卵巢癌等。Stat3的活化有利于诱导肿瘤细胞增殖、抑制细胞凋亡,从而使癌症恶化;而通过RNAi或小分子抑制剂抑制Stat3的表达,可抑制肿瘤细胞增殖、侵袭,诱导细胞凋亡;且在对NSCLC的研究中发现,下调Stat3的表达可抑制肿瘤生长。揭示Stat3可能是NSCLC治疗的潜在靶点。EGFR具有酪氨酸蛋白激酶活性,研究表明,EGFR过表达可导致细胞过度生长和恶性肿瘤,Stat3是STAT家族肿瘤细胞和癌组织中表达最活跃的转录因子。研究证明,应用EGFR单克隆抗体治疗后,抑制Stat3的磷酸化,细胞增殖、侵袭能力降低,促进细胞凋亡,这些结果表明EGFR-STAT3信号转导途径作用于肺癌细胞增殖过程中起到重要作用。目前实验研究表明JAK-STAT3信号转导通路和ADAM9-EGFR信号转导通路对NSCLC发生发展起到促进作用,两条信号转导通路在肿瘤的发生发展中存在信号对答。目的:探讨JAK-STAT3与ADAM9-EGFR信号转导通路在NSCLC中的关系方法:构建ADAM9 sh RNA、Stat3 sh RNA以及对照组的慢病毒载体,并转染至293T细胞,从而分别获得表达ADAM9 sh RNA慢病毒(Lv/sh-ADAM9)、Stat3 sh RNA慢病毒(Lv/sh-Stat3)或非沉默sh RNA慢病毒(Lv/sh-NC),用慢病毒Lv/sh-Stat3、Lv/sh-ADAM9、Lv/sh-NC单独感染A549细胞,或Lv/sh-Stat3和Lv/sh-ADAM9联合感染细胞。分别采用RT-q PCR技术和WB方法检测细胞中Stat3和ADAM9 m RNA和蛋白表达水平。通过CCK-8方法检测A549细胞增殖水平。TUNEL方法检测细胞凋亡;检测细胞caspase-3、caspase-8和caspase-9活性。细胞划痕实验检测细胞迁移能力。Transwell方法分析细胞侵袭水平;检测细胞MMP-2和MMP-9蛋白表达水平。雄性BALB/c裸鼠皮下注射A549细胞以构建NSCLC荷瘤裸鼠模型,并对荷瘤小鼠注射慢病毒Lv/sh-NC、Lv/sh-ADAM9、Lv/sh-Stat3或Lv/sh-ADAM9和Lv/sh-Stat3联合进行治疗,对肿瘤体积及重量进行测量;通过TUNEL方法检测肿瘤细胞凋亡水平。结果:所构建慢病毒载体经PCR和测序鉴定无误;重组质粒可成功转染至293T细胞中;慢病毒Lv/sh Stat3和Lv/sh ADAM9可分别或者共同感染A549细胞。RNAi介导的Stat3或ADAM9基因沉默可分别抑制A549细胞Stat3或ADAM9 m RNA和蛋白表达,二者基因共沉默同样可抑制Stat3和ADAM9 m RNA和蛋白表达。RNAi介导的Stat3或ADAM9基因沉默均可抑制A549细胞的体外增殖,而二者基因共沉默在抑制细胞增殖上显示出协同效应。RNAi介导的Stat3或ADAM9基因沉默均可诱导A549细胞的体外凋亡,二者基因共沉默对细胞凋亡的诱导作用更为显著。RNAi介导的Stat3或ADAM9基因沉默均可抑制A549细胞体外迁移和侵袭,而二者基因共沉默对细胞侵袭显示出协同抑制作用。RNAi介导的Stat3和ADAM9基因共沉默可抑制MMP-2和MMP-9蛋白表达,与细胞迁移和侵袭能力的变化一致,揭示MMP-2和MMP-9参与A549细胞的体外迁移和侵袭。RNAi介导的体内Stat3或ADAM9基因沉默可抑制NSCLC肿瘤组织生长,二者基因共沉默对肿瘤组织生长的抑制作用更强。结论:ADAM9和Stat3基因共沉默可协同抑制体外NSCLC增殖、迁移和侵袭能力,并诱导细胞凋亡,能够协同抑制体内肿瘤生长。JAK-STAT3与ADAM9-EGFR信号转导通路在NSCLC发生发展过程中起协同作用。Stat3不是JAK-STAT3与ADAM9-EGFR两条信号转导通路下游的共同关键节点。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2

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本文编号：1635688