MiR-302c-3p通过下调MTDH的表达抑制胶质瘤细胞侵袭和增殖能力的作用机制研究

发布时间：2018-03-20 04:33

本文选题：micro　切入点：RNA-302c-3p　出处：《山西医科大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：人脑胶质瘤,起源于中枢神经系统中胶质细胞或其前体,是成人原发性脑肿瘤最常见的形式,约占整个颅内肿瘤的30%,高度恶性脑胶质瘤(WHOⅢ、Ⅳ级)没有成功的治疗方法,确诊后病人的平均生存时间约为12-15个月.由于胶质瘤具有高度侵袭性和浸润正常脑组织,因此手术难以全切,预后不佳,且术后复发率高,易发生颅内或脊髓及其他部位转移,病程进展快,一年生存率不足50%。脑胶质瘤的治疗包括手术切除联合放疗加化疗或靶向治疗,这样能显著增加生存率,然而高级别胶质瘤和预后差之间的相关性的机制仍然未知,因而,有关颅内胶质瘤的发病机理以及治疗方法研究一直以来都是神经科学领域研究的热点。所有级别的神经胶质瘤是以不适当的增殖,浸润正常的脑组织为特征的,从而破坏正常的脑功能。所以只有明确胶质瘤致病分子机制,我们才可以找到新的治疗方法。Micro RNA(mi RNA)是21到23个核苷酸的内源性非编码的小的核糖核酸序列,在翻译后水平通过结合目标信使RNAs的3′UTR区域的互补序列,来负调控基因表达,在转录后水平诱导信使RNA降解或翻译抑制的表达。许多mi RNAs被证明是原癌基因或在多种人类肿瘤中肿瘤抑制基因,包括胶质瘤.近年来的研究表明,mi RNAs,如mi R-7,mir-124,mir-128,mi R-107,和mi R-181b,在神经胶质瘤中都是异常调节。然而,通过其中哪一种mi RNA介导胶质瘤肿瘤的发生和转移特定的分子机制仍在很大程度上是未知的。因此,确认并鉴定新的mi RNA在胶质瘤中的作用,可提供新的视点来理解脑胶质瘤发展的分子机制。Micro RNA-302c-3p(mi R-302c-3p)是mi R-302/367家族家族中的重要一员,人源mi R-302/367家族基因定位于4号染色体q25区,包括mi R-302a/b/c/d和mi R-367等成员。早期的研究主要集中于mi R-302/367可以作为重要的调节因子在胚胎干细胞作用,包括干细胞更新和多能性的维持等功能。近年来的研究表明,mi R-302/367在肿瘤、免疫性疾病和心血管等疾病中也具有重要的调节功能,通过靶向调节不同靶基因在不同的疾病中发挥着不同的生物学作用。肿瘤发生发展是一个多阶段、多因素参与的复杂的生物学过程。已有研究结果表明,mi RNAs几乎参与肿瘤发生发展的整个过程,其中mi R-302/367在多种肿瘤中扮演着重要的角色。基于Leivonen?s的研究,mir-302c在实验模型中的表达是降低的,其他人发现它可能参与了肝癌转移,并建议mir-302c可能在胶质瘤演进中发挥重要作用。在本项研究中,我们首先检测mi R-302c-3p在脑胶质瘤患者的肿瘤组织中表达,以及通过一系列的体外和体内实验研究,然后进行调查探索影响mir-302c-3p在胶质瘤中表达的机制。通过生物信息学分析软件(RNA22)和实验验证,我们发现异粘蛋白(MTDH)是mi R-302c-3p上调的直接的靶目标。与正常脑组织相比,胶质瘤组织中MTDH表达上调,与mi R-302c-3p表达呈负相关。最后,在体内和体外的实验中发现mi R-302c-3p的过度表达可以强烈的抑制胶质瘤细胞的侵袭与增殖。本课题从分子水平研究mi R-302c-3p影响胶质瘤细胞恶性生物学行为的机制,对于深入理解mi R-302c-3p的生物学功能和胶质瘤的发生和转移特定的分子机制有重要意义,是胶质瘤治疗的一个潜在抑制剂,具有重要的理论意义和应用前景。本课题将从三个方面进行研究:1.mi R-302c-3p在正常人脑组织与胶质瘤组织中的表达及意义目的:比较研究胶质瘤与正常脑组织之间以及不同等级胶质瘤之间mi R-302c-3p以及MTDH m RNA表达差异性。分析mi R-302c-3p的表达与胶质瘤临床病理分级之间的关系,在此基础上,进一步通过双荧光素酶报告基因检测技术验证MTDH是否为mi R-302c-3p作用的靶标蛋白。为进一步探索mi RNA-302c-3p在胶质瘤体内外的生物学作用奠定基础。方法:利用q RT-PCR技术比较6例正常脑组织以及27例不同等级胶质瘤之间mi R-302c-3p以及MTDH m RNA表达情况,通过双荧光素酶报告基因检测技术验证MTDH与mi R-302c-3p的相关性。结果:(1)q RT-PCR法检测结果显示,在胶质瘤组织与正常脑组织相比,mi R-302c-3p表达水平显著减少(0.39±0.04 vs.1.06±0.03,P0.001)。此外,mi R-302c-3p的表达水平在胶质瘤高级别(WHOⅢ和WHOⅣ)中明显低于那些低级别的(WHOⅠ和WHOII)(0.27±0.03 vs.0.66±0.05,P0.001);(2)MTDH与mi R-302c-3p相关性分析:我们比较了在27例人脑肿瘤与6例正常脑组织中的MTDH基因的表达水平。MTDH的表达通过实时定量PCR(q RT-PCR)分析发现,与正常脑组织相比较,胶质瘤组织中MTDH表达显著增加,(p=0.0027)。与正常组织相比,MTDH基因在胶质瘤组织中的过度表达在85.2%(23/27)。为了进一步评估在胶质瘤中mi R-302c-3p和MTDH表达相关性,我们比较27个人脑胶质瘤标本mi R-302c-3p和MTDH的表达。结果显示:MTDH和mi R-302c-3p表达呈显著负相关(P=0.003,R2=0.4065)。1.mi R-302c-3p对胶质瘤细胞生物特性的体外研究目的:验证mi R-302c-3p的靶目标是MTDH及与其基因表达的关系。观察体外mi R-302c-3p的过度表达对U87MG的增殖和侵袭能力能力的影响。方法:(1)利用micro RNA生物学信息软件RNA22发现,发现mi R-302c-3p靶目标是MTDH。基于预测软件的基础,RNA22(https://cm.jefferson.edu/rna22v1.0-homo_sapiens/Get Inputs.jsp),我们发现MTDH的3?UTR包含mi R-302c-3p种子区域互补的位点(位置2271~2293),可能是mi R-302c-3p个潜在的靶目标。为了验证mi RNA与靶目标的相互作用并决定是否mi R-302c-3p抑制MTDH基因的表达,通过在胶质瘤细胞内环境MTDH信使RNA的3?UTR直接相互作用,用荧光素酶检测。为了分析评估转染了LV-302c-3p或LV-NC的U87MG的增殖能力,实验分为阴性对照组(LV-NC)组,转染组(LV-302c-3p组);我们采用CCK-8细胞测定检测细胞增殖能力。对于细胞侵袭实验,使用一个具有BD Bio Coat Matrigel专门的小室。简而言之,细胞(5×104细胞/毫升)装入一个包含8毫米孔径薄层的基质膜小室。在24或48小时内迁移到膜的下表面细胞的用100%甲醇固定,在膜的上表面的非侵袭细胞去除。具有侵袭细胞的膜用DAPI(D9564,Sigma)染色,扫描,用显微镜取得数字图像。显微镜下侵袭细胞计数,至少5个视野。每个实验数据3次测量取均数用来分析。将包含靶点的序列连接进p MIR-Report vector的luciferase报告质粒中。U87MG转染mi RNA-302c-3p mimics(40 nmol)24小时后,再用Lipofectamine2000二次转染携带野生和突变型MTDH 3’UTR。48小时后,与dual-luciferase reagents(E1483,Promega)孵育,最后用dual-luciferase reagents(E1483,Promega)检测荧光素酶活性。CCK-8试剂盒测定转染了LV-302c-3p或LV-NC的U87MG细胞的增殖情况,用Transwell试验检测mi R-302c-3p过表达对胶质瘤细胞的侵袭能力的影响。结果:(1)结果表明在野生型组,mi R-302c-3p模拟抑制荧光素酶的活性大约69.6%(P=0.005),而在变异组或阴性对照组没有明显的变化,这表明mi R-302c-3p可以与MTDH的3?UTR的种子序列直接结合,并抑制其表达。(2)与阴性对照相比,转染了LV-302c-3p的U87MG细胞增殖率减明显减少(3)转染了LV-302c-3p或LV-NC的U87MG细胞接种于基质胶小室,经过24小时的培养后具备了其侵袭能力。结果表明,与对照组相比,侵袭性U87MG细胞过量表达mi R-302c-3p的能力降低了82.4%2.mi R-302c-3p对胶质瘤细胞生物特性的体内研究目的:为了进一步探讨mi R-302c-3p抑制在体内的成瘤,我们把u87mg-302c-3p和u87mg-nc细胞植入裸鼠,观察成瘤能力。把C6-302c-3p和C6-NC植入S-D大鼠的大脑,观察脑内成瘤能力。方法:构建的慢病毒载体介导对mir-302c-3p表达,建立了2个稳定的细胞株,分别命名为u87mg-302c-3p和u87mg-nc。实时荧光定量PCR检测结果表明u87mg-302c-3p细胞表达mi R-302c-3p是对照细胞u87mg-nc的15.4倍,说明建构是成功的。然后,我们把u87mg-302c-3p和u87mg-nc细胞植入裸鼠。为了进一步探讨mi R-302c-3p的抑制作用在脑肿瘤的发生,C6细胞转染lv-302c-3P然后注入大脑。转染LV-NC细胞作为对照组。注射后第二十一天,进行磁共振成像分析和组织病理分析。结果:(1)与U87MG-302c-3p细胞相比,小鼠腹腔注射u87mg-nc细胞形成较大的肿瘤(P=0.004)(2)与C6-302c-3p细胞相比,注射c6-nc细胞右脑形成更大的肿瘤细胞结论:(1)在胶质瘤组织与正常脑组织相比,mi R-302c-3p表达水平显著减少。且随着肿瘤等级的增高,表达量逐渐下调,提示mi R-302c-3p与胶质瘤恶化程度相关,有可能作为胶质瘤分级的一个标志物。正常组织相比,肿瘤组织中MTDH表达明显上调。mi R-302c-3p与MTDH两者之间表达呈一定的负相关性。MTDH是mi RNA-302c-3p作用的靶标蛋白。(2)转染了LV-302c-3p的U87MG细胞增殖率减明显减少,侵袭性U87MG细胞过量表达mi R-302c-3p的能力降低了82.4%(3)体内成瘤的实验证实mi R-302c-3p稳定过表达抑制神经胶质瘤细胞的成瘤能力。
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【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.4

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