盐霉素诱导细胞周期阻滞和抗血管生成抑制人脑胶质瘤生长机制研究

发布时间：2018-03-20 05:11

本文选题：盐霉素　切入点：胶质瘤　出处：《山东大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：胶质瘤指源于神经胶质细胞的脑部肿瘤。流行病学资料显示胶质瘤在全部中枢神经系统肿瘤类型所占比例为27%,在恶性肿瘤类型所占比例为80%,是最常见原发性肿瘤类型。世界卫生组织(World Health Organization,WHO)将胶质瘤分级WHO Ⅰ～Ⅳ级,以判断肿瘤恶性程度。高级别胶质瘤具有较强的侵袭性,临床治疗效果差,患者预后不佳,平均生存率只有12-15个月。尽管采取目前的方法来治疗胶质瘤其疗效不能让人满意,但是手术切除后和放疗后采取合适的化疗药物进行化疗仍然是不可替代的方案。盐霉素(salinomycin,SAL)为一种一元羧酸聚醚类动物专用抗生素。2009年,美国人率先证实SAL能够有效地杀死乳腺癌肿瘤干细胞。之后SAL在各类肿瘤实验性研究被证实对多种类型肿瘤细胞与肿瘤干细胞具有抑制与杀伤,如鼻咽癌,骨肉瘤,肝细胞癌,胆管癌,胃癌以及胶质瘤等。盐霉素抗肿瘤的机制研究表明其具有广谱的抗癌活性,它可能通过激活非传统的细胞死亡途径,诱导脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)损伤,抑制Wnt信号通路,凋亡和/或自噬,抗血管新生等机制发挥作用。报道据盐霉素能够提高细胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)含量,从而导致细胞凋亡或坏死,DNA损伤以及抑癌基因p53活化抑制胶质瘤细胞增生。而且大量证据提示,ROS在SAL抗癌作用机理中起到主要作用。然而盐霉素利用氧化应激反应诱导细胞周期阻滞的研究未见报道。因此在本研究中,将评价在盐霉素引起U87人胶质瘤细胞周期阻滞的过程中,ROS、DNA损伤以及丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/theronine protein kinase,AKT)失活所起到的作用。血管生成机制为肿瘤向远处转移与生长机制当中主要组成部分。肿瘤只有在丰富的血管床支持下,在得到足够的氧气和营养物质的基础上才可能生长与延伸,因此血管发生与肿瘤生长是平行的。肿瘤组织内新血管生成为多重机制参与,多个成分参加的复杂过程,并且受到由肿瘤细胞等分泌的促血管生成与抗血管生成因子调节。两种因子生成达到平衡时,血管新生处于相对静止,而平衡破坏时即触发血管新生。肿瘤血管生成有2种基本形式,出芽与套叠式血管生成。肿瘤血管生成特点比较突出,如高度增殖的内皮细胞,血管通透性比较高以及促血管生长因子分泌旺盛,因此可以将血管生成作为治疗新靶点。当血管生成启动后,肿瘤细胞会分泌出促血管形成因子诱导内皮增殖。由肿瘤细胞产生的具有促血管生成效应的分子逐渐被人们所认识,也鉴定出多种类似于内皮细胞分泌的促血管生成分子。最近许多文献报道,以血管生成的调节因子为治疗靶点,通过小分子受体阻滞抑制剂、特异性抗体或内源性抑制剂来抑制内皮细胞聚积。实验研究证实以血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)作为治疗靶点可以有效阻滞血管发生。VEGF是组织结构和功能有关的细胞因子家族当中非常重要的一员,在血管发生、促进细胞生存、生长方面起到重要作用,并和VEGF受体结合调节动脉、静脉中内皮增殖。目前已经鉴定出三种不同血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factorreceptor,VEGFR),VEGFR-1(Flt-1),VEGFR-2(Flk-1)和 VEGFR-3。局部黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)为一种胞浆蛋白质络氨酸激酶,与整合蛋白介导的通路密切相关,在细胞增生,存活与迁移活动内起到关键作用。整合蛋白聚类激活FAK,后者又引起PI3K结合位点Tyr397磷酸化。已有文献证实不论是整合蛋白介导FAK活化,或是生长因子刺激促进了 PI3K/Akt下游途径活化,均会引起癌性转移前蛋白过度表达,例如基质金属蛋白酶与VEGF。盐霉素抗肿瘤机制研究中有证据显示,其通过引起DNA损伤与线粒体功能障碍,以及 FOX03a,Wnt/β-catenin,STAT3/Skp2 和 Akt/NF-κB/mTOR 信号通路参与的ROS聚集这些机制来抑制胶质瘤细胞生长。但是少有文献报道SAL对肿瘤血管发生影响。因此本研究将盐霉素作为血管生成抑制剂评价其在离体和在体情况下的抗癌作用。并探究其抑制血管生成和引起胶质瘤细胞死亡的潜在机制。目的1.探讨SAL在离体情况下对U87与U251胶质瘤细胞系和在体情况下对U87胶质瘤细胞移植瘤生长的抑制,围绕细胞周期阻滞探讨潜在机制。2.探讨SAL在离体情况下对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)增殖、迁移、侵袭和血管形成能力的影响,在体情况下对U251胶质瘤细胞移植瘤生长的抑制作用,围绕血管生成探讨其潜在机制。方法1.体外培养U87和U251胶质瘤细胞并扩增,设正常对照组和SAL治疗组。以不同浓度SAL(0,1,2,4,8μM)治疗48h,倒置相差显微镜观察细胞形态,四氮唑溴盐(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT)法检测细胞活力。应用细胞流式技术分析细胞周期分布。DCFH-DA探针测定细胞内ROS水平,超氧阴离子试剂盒测定细胞内超氧阴离子含量。蛋白质印迹法测定 SAL 对细胞周期调节因子 CyclinA、CDK-2、CyclinB1 和 CyclinD1,DNA损伤标记蛋白H2A和p53,和其他信号途径蛋白(AKT)表达影响。应用各种蛋白抑制剂与ROS清除剂谷胱甘肽探讨SAL对细胞周期影响。构建U87胶质瘤细胞移植瘤模型,分组设对照,对比移植瘤大体形态参数与模型体重。对肿瘤标本进行蛋白质印迹法与免疫组织化学分析。2.体外培养 HUVECs 并扩增。不同浓度(0 uM,0.1 uM,0.5 uM,1 uM,2 uM,4 uM,8 uM)的SAL作用HUVECs 48 h。倒置相差显微镜记录细胞形态,MTT法检测细胞活性。划痕试验、体外侵袭实验和促血管形成实验评价SAL作用后HUVECs的迁移能力、侵袭能力和血管形成能力,并设立阳性(VEGF)和阴性(顺铂)对照。蛋白质印迹法测定SAL对血管生成调节因子VEGF,VEGF受体,以及其他信号途径蛋白(p-FAK、FAK、AKT、p-AKT)表达的影响。增加使用各种蛋白抑制剂探究SAL对血管发生影响。构建U251胶质瘤细胞移植瘤模型,分组设对照,对比移植瘤大体形态参数与模型体重。对肿瘤标本进行蛋白质印迹法与免疫组化分析。结果1.在SAL作用下,由MTT分析得到的U87和U251细胞活力受到明显抑制,呈剂量依赖性;镜下显示细胞萎缩,突触缩减,数量变小。流式细胞技术结果表明SAL主要诱导U87细胞S期和U251细胞G1期细胞周期抑制,蛋白质印迹法显示Cyclin A、CDK-2、Cyclin B1和Cyclin D1表达下调,结果保持一致。SAL作用下细胞内ROS和超氧阴离子水平增高,H2A和p53表达增强,而增加谷胱甘肽后H2A和p53表达下降,提示ROS引起DNA损伤。蛋白质印迹法结果显示SAL作用下p-AKT表达下调,增加LY294002(AKT抑制剂)后表现出两者的协同作用,增加谷胱甘肽后两者表现出对p-AKT表达的拮抗作用。动物实验数据提示肿瘤标本体积和重量受到SAL抑制。免疫组化结果显示肿瘤组织内的细胞增生(Ki-67染色)和血管发生(CD-31染色)同样受到抑制。蛋白质印迹法结果盐霉素激活了 Ser15-p53和Ser139-H2A,抑制了 AKT和cyclinA表达。综合以上结果表明,盐霉素在体内可以抑制胶质瘤生长。2.MTT分析提示SAL对HUVECs生长具有剂量依赖性抑制作用,镜下显示细胞数量减少,细胞形态萎缩和变圆。划痕试验、体外侵袭实验和促血管形成实验数据提示盐霉素能够阻止HUVECs迁移,侵袭和形成类毛细血管形成。蛋白质印迹法提示SAL作用下p-FAK表达下调,联合使用PF562271能增强这种作用,提示SAL抑制HUVECs中FAK的磷酸化。蛋白质印迹法还表明,SAL作用下VEGF、p-VEGFR2与p-AKT表达下降,提示SAL干扰了VEGF-VEGFR2-AKT信号途径。SAL作用下在体肿瘤体积和重量下降,免疫荧光染色显示细胞增生的标记物Ki-67和造血祖细胞标记物CD34表达,同时蛋白质印迹法显示治疗组织内p-FAK和p-AKT表达减少,以上结果提示盐霉素通过阻碍血管新生抑制体内胶质瘤生长。结论1.盐霉素通过ROS介导的DNA损伤和AKT失活引起细胞周期阻滞,从而抑制胶质瘤的生长。2.盐霉素通过干扰VEGF-VEGFR2-AKT/FAK信号轴能够阻止血管生成和抑制胶质瘤生长。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R739.41

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