药物代谢酶含量测定的液相色谱—平行反应监测质谱方法的建立及应用

发布时间：2018-03-21 13:29

  本文选题：药物代谢酶　切入点：稳定同位素稀释平行反应监测质谱法　出处：《郑州大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景I相药物代谢酶细胞色素P450氧化酶(cytochrome P450 oxidase,CYP450)和II相药物代谢酶尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UDP-glucuronide transferases,UGTs)主要存在于肝脏中,参与多种内外源性化合物(包括药物)的代谢,Cytochrome P450 oxidoreductase(POR)和cytochrome b5(b5)作为药物代谢酶的供电子物质在药物代谢中也具有重要的作用。CYP450和UGTs的多态性和含量差异是引起药物药效个体差异的重要因素,肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是我国常见的肿瘤之一,临床上,肝癌及其并发症治疗时药物的剂量需要及时调整,然而,作为剂量调整的基础,CYP及UGT的含量在HCC病人中是如何改变的,至今尚不完全清楚,因此,CYP450和UGTs含量的研究对肝癌病人临床个体化治疗方案的制定有重要意义。目前测定肝药酶含量的常用方法有免疫印迹法(Western blot)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)。其中,基于抗原抗体结合原理的Western blot法和ELISA法虽具有高灵敏度的特点,但特异性抗体制备困难,并且无法同时对同一样本中的多种蛋白定量。而LC-MS/MS不需要制备特异性抗体,并具有高通量、高特异性以及线性范围宽等特点。本文建立了液相色谱-平行反应监测质谱方法(liquid chromatography parallel reaction monitoring mass spectrometry,LC-PRM/MS),与选择反应监测质谱方法相比,LC-PRM/MS能够获得二级的所有碎片信息,并且结果能够搜库,保证定量的特异性。我们将建立的方法应用于肝癌病人肝硬化组织中的药物代谢酶含量的测定,期望为肝癌病人的临床用药提供参考。本论文共分为两个部分。第一部分使用稳定同位素标记技术制备了定量肽段串联体蛋白(Quantification concatemer,Qcon CAT);第二部分建立了平行反应监测方法,并将该方法应用于药物代谢酶的定量中。研究方法1.内标肽段的制备20种药物代谢酶和POR以及b5各挑选2-3条特异性肽段,将选出的特异性肽段串联成为了Qcon CAT蛋白,构建可以表达该蛋白的基因序列,将其导入大肠杆菌后使用含重标精氨酸和赖氨酸的SILAC培养基进行诱导表达,表达成功的重组蛋白使用GST填料进行纯化,SDS-PAGE鉴定纯度,并使用Trypsin进行酶解。2.内标肽段酶切效率和标记效率的考察酶切后的肽段使用数据依赖采集模式考察酶切效率和标记效率,使用Proteome Discoverer 2.1搜库检索,对酶切肽段定性。3.内标肽段的定量化学合成一条CYP1A2的标准肽段ASGNLIPQEK,使用氨基酸水解法进行定量,将含量已知的标准肽段梯度稀释,加入等量的内标肽段,使用液相质谱进行检测,计算内标肽段的含量。4.人肝微粒体的定量及酶切使用差速离心法制备人肝微粒体(Human liver microsomes,HLMs),用Bradford法对人肝微粒体进行定量,定量后取出10μg蛋白使用Trypsin酶切26小时。5.液相-质谱平行反应监测方法的建立将定量后的内标肽段与酶切后的人肝微粒体混合,使用数据依赖扫描模式,更换三根预柱,平行测定两次,结果使用Proteome Discoverer 2.1搜库鉴定,确定目标肽段的保留时间和定量限,并筛选用于定量的子离子。6.标准曲线的建立将Qcon CAT蛋白梯度稀释,加入等量酶切后的人肝微粒体,使用液相色谱-平行反应监测质谱方法进行扫描,建立定量肽段的标准曲线。7.液相-质谱平行反应监测方法的应用将建立的平行反应监测方法应用于肝癌病人肝硬化组织中药物代谢酶含量的测定。研究结果1.重组蛋白纯度鉴定及定量SDS-PAGE分析结果表示,表达的重组蛋白纯度较高。使用Bradford法对重组蛋白进行定量,标准品的方程为y=9.8617x+0.1537,R2=0.9876,蛋白浓度为0.56 mg/m L。2.重组蛋白的定性使用Proteome Discoverer 2.1搜库匹配目标蛋白质信息,所有内标肽段均为目标蛋白的特异性肽段,匹配情况良好。3.重组蛋白酶切效率及标记效率的考察经分析,纯化蛋白仅存在一个漏切位点,占所有肽段的10%以下,即酶切效率高,各个肽段标记的均一性良好,标记效率均达到90%。4.重组蛋白的绝对定量使用子离子y5和y4的平均值作为Qcon CAT的定量结果,即134.75fmol;与两组定量曲线使用母离子的定量结果相差不到1.1倍。5.定量肽段保留时间和子离子的设置相同肽段使用不同色谱柱进行色谱分离时,肽段的保留时间存在的偏差,而在同一色谱柱上对相同肽段的保留时间偏差小于1分钟。使用搜库结果中信号强度最高的三个子离子用于肽段的定量。6.标准曲线的建立使用PRM方法建立药物代谢酶定量肽段的标准曲线,R2值均在0.98以上,动态范围为5-200fmol。7.肝癌病人肝硬化组织中药物代谢酶的定量共测定12例样本中6种药物代谢酶的含量。CYP1A2、UGT1A1、UGT2B4、UGT2B15、POR以及b5在样本中的含量均值分别为67.36 fmol/μg、87.25 fmol/μg、92.97 fmol/μg、53.01 fmol/μg、140.65 fmol/μg以及84.91 fmol/μg。个体差异倍数分别为6.5、5.02、5.24、4.33、6.17和4.02倍;与正常组织相比,POR在肝癌病人的肝硬化组织呈高表达,UGT1A1与UGT2B15的含量与正常组织比有所降低,且差异显著(p0.05)。结论1.本研究构建了串联体蛋白,实现了规模化内标肽段的制备,并保证了内标的纯度与标记效率;2.建立了药物代谢酶的PRM分析方法,在此基础上建立了绝对定量的标准曲线,线性关系为0.99,动态范围为5-200fmol;3.使用建立的方法测定了12例样本中6种药物代谢酶的含量,CYP1A2、UGT1A1、UGT2B4、UGT2B15、POR以及b5在样本中的含量均值分别为67.36 fmol/μg、87.25 fmol/μg、92.97 fmol/μg、53.01 fmol/μg、140.65 fmol/μg以及84.91fmol/μg。将结果与正常组织的结果进行比较,POR在肝癌病人的肝硬化组织呈高表达,UGT1A1与UGT2B15的含量与正常组织比有所降低,且差异显著(P0.05)。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.7

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本文编号：1644057