靶向黏蛋白uMUC1的荧光探针对人乳腺癌细胞MCF7进行显像的初步研究

发布时间：2018-03-22 12:37

  本文选题：乳腺癌　切入点：uMUC1　出处：《北京协和医学院》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：乳腺癌的发病率居女性恶性肿瘤首位,因此乳腺癌的早期诊断、早期治疗对乳腺癌患者至关重要。分子影像学运用影像学手段检测组织中疾病相关分子的变化,从分子水平对组织细胞进行区分,因此对疾病的早期检出、早期治疗及诊疗一体化有重要价值。黏蛋白MUC1 (mucin1)在上皮细胞中广泛表达,而在乳腺癌中其糖基化水平明显降低、表达量明显升高,且在细胞表面分布失去极性。因此,靶向去糖基化MUC1 (uMUC1)可能对于乳腺癌早期识别、乳腺癌的预后评估及治疗方式选择有帮助。目前,靶向uMUC1荧光探针用于临床早期乳腺癌影像诊断尚缺乏深入研究。为了研究靶向uMUC1荧光探针对乳腺癌细胞的显像效果,我们选取了抗uMUC1抗体(VU4H5)用于构建靶向探针。为了确定该抗体对uMUC1阳性乳腺癌细胞系MCF7细胞的结合效果,我们用抗体孵育MCF7细胞后进行了流式细胞分析。结果表明与抗uMUC1抗体孵育的MCF7细胞其荧光强度明显超过与对照Normal IgG孵育的MCF7细胞,说明抗uMUC1抗体可以结合MCF7细胞。同样地,我们用抗uMUC1抗体孵育另一uMUC1阳性细胞系MDA-MB-468细胞,流式细胞术结果提示抗uMUC1抗体也可以与MDA-MB-468细胞结合。以上结果表明,抗uMUC1抗体能够结合已知uMUC1阳性乳腺癌细胞系。在小鼠体内评估靶向荧光探针的灵敏度和特异度的工具细胞应具有可检测和可追踪的特性。而绿色荧光蛋白(GFP)作为常用的荧光标签蛋白可被影像设备所检测。因此,为了获得可追踪检测的MCF7细胞,我们在MCF7细胞中整合表达GFP。首先,我们用hU6-MCS-Ubiquitin-eGFP-IRES-puromycin慢病毒感染MCF7细胞。实验结果显示,病毒的感染复数(multiple of infection, MOI)为50及同时使用5μg/mL聚凝胺(polybrene)时感染效率最高。随后,我们使用3μg/mL的嘌呤霉素(puromycin)对慢病毒整合MCF7细胞进行筛选。经过2周持续的筛选及连续传代后,我们获得了稳定表达GFP的细胞株MCF7-GFP。通过细胞生长曲线、划痕实验及碘化丙啶(PI)单染法流式细胞周期检测实验,我们发现MCF7-GFP细胞与MCF7对照细胞的增殖状态及细胞周期没有显著差别。此外,我们利用生物光学成像系统(Xenogen, IVIS 300)对MCF7-GFP细胞进行了荧光成像,确认了MCF7-GFP细胞可被荧光成像系统检测。以上结果表明,我们构建的MCF7-GFP细胞株稳定表达GFP且增殖速率与MCF7细胞无明显差异。慢病毒可将外源基因随机整合入宿主基因组并进行复制,进而可能对宿主自身的基因表达造成干扰,因此我们检测了MCF7-GFP细胞的uMUC1表达情况。免疫印迹法及流式细胞术结果均显示,MCF7-GFP细胞较野生型MCF7细胞的uMUC1表达量下降,但流式细胞分析结果提示抗uMUC1抗体仍可以特异性地结合MCF7-GFP细胞。以上结果表明,虽然MCF7-GFP细胞uMUC1表达量较MCF7细胞有所降低,但仍适用于靶向uMUC1探针成像的研究。接下来,我们使用具有活性基团N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS Ester)的IRDye800染料与抗uMUC1抗体进行偶联得到抗uMUC1-IRDye800探针,并使用活体成像系统评价其对MCF7-GFP细胞的结合效率。我们发现10μg/mL的探针在37℃与细胞孵育30min后与细胞结合。而随着孵育时间的延长,其结合率没有显著增高。同时,我们使用IRDye800羧化物(Carboxylate)作为阴性对照探针研究抗uMUC1-IRDye800探针与细胞结合的特异性。我们发现,在探针浓度为10μg/mL时与抗uMUC1-IRDye800探针孵育的细胞的荧光强度明显高于与阴性对照探针孵育的细胞；且随着探针浓度的增加,荧光强度逐渐增加。然而,与阴性对照探针孵育的细胞的荧光强度随着探针浓度的增加没有显著改变。随后,我们通过MTT法检测探针对细胞的毒性作用发现,抗uMUC1-IRDye800探针仅在高浓度(50μg/mL)时对MCF7-GFP细胞产生明显的毒性作用。以上结果表明,抗uMUC1-IRDye800探针能有效靶向MCF7-GFP细胞且在有效浓度下无明显细胞毒性。综上所述,本研究构建了一株稳定表达GFP的人乳腺癌MCF7细胞株,并初步利用抗uMUC1抗体(VU4H5)与IRDye800结合探针成功地在体外对MCF7-GFP细胞进行了荧光成像。该研究为将来在动物体内开展乳腺癌影像研究提供了一株工具细胞株,也为靶向uMUC1荧光探针用于乳腺癌显像提供了初步的实验基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9

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本文编号：1648706