EpCAM N-糖基化修饰对乳腺癌细胞EMT的调控及对粘附能力的影响

发布时间：2018-03-22 17:09

  本文选题：乳腺癌　切入点：上皮细胞粘附分子　出处：《大连医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：乳腺癌是常见的恶性肿瘤之一,其发病率呈逐年上升的趋势。乳腺癌占全身各种恶性肿瘤的7%-8%,国内发病率高于世界平均水平1%-2%,目前乳腺癌多采用手术治疗、放射治疗、化学治疗等,手段单一,难以达到满意的效果。因此寻找有效治疗乳腺癌的方法具有一定的临床意义。上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)指肿瘤细胞发生转移时,伴随着细胞形态学变化,即上皮细胞向间充质细胞的转变,侵入到基底膜下面,进入到血管中散播至第二个地方。在此过程中,肿瘤细胞从原发位置脱落,然后侵入到周围的组织中,获得了浸润性和游走的迁移能力,突破细胞之间的接触,形成细胞-基质的粘附位点,通过基质中的蛋白酶来完成趋化过程。一些研究表明,EMT与上皮细胞肿瘤的发生、发展过程具有密切的联系。目前已发现肿瘤细胞转移可以改变粘附分子(Cell Adhesion Molecules,CAMs)的表达。肿瘤细胞表面CAMs表达异常,可能会造成肿瘤细胞粘附性降低而脱落到细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)中,促进肿瘤浸润与转移过程。上皮细胞粘附分子(Epithelial Cell Adhesion Molecule,EpCAM)是由314个氨基酸残基构成的分子量为40 k Da的跨膜糖蛋白,包含N-端的胞外区,跨膜区和C-端的胞内区。EpCAM是不同于CAMs经典家族成员,具有潜在的致癌性。在正常条件下,除鳞状上皮细胞,EpCAM在正常上皮细胞中都有不同程度地表达。在病理情况下,EpCAM在腺癌中高表达,包括乳腺癌、肺腺癌、卵巢癌、胰腺癌等。EpCAM一级结构显示,EpCAM N-端细胞外域包含三个N-糖基化位点,分别是Asn74、Asn111、Asn198。文献已报道,将此三个糖基化位点去除可使EpCAM的半衰期由21小时缩短至7小时,表明N-糖基化位点对于维持EpCAM的功能是必不可少的。另外,与正常组织相比,EpCAM糖基化的差异是引起肿瘤功能差异的重要因素。因此,推测在乳腺癌细胞中EpCAM的N-糖基化修饰可能是激活和调节EMT信号转导的关键。本课题前期工作致力于EpCAM对乳腺癌细胞EMT的调节作用和机制研究,实验结果证实:在TGF-β1诱导下通过JNK通路,转录因子AP-1调控EpCAM的表达从而影响乳腺癌细胞EMT的发生。本实验深入探究EpCAM N-糖基化修饰对乳腺癌细胞EMT的调控机制,为乳腺癌的治疗方法提供一定的理论基础。首先,将EpCAM N-糖基化突变质粒瞬时转染到乳腺癌细胞(MCF-7、MDA-MB-231),结果表明EpCAM在乳腺癌细胞中表达糖基化和非糖基化蛋白两种形式。通过细胞免疫荧光技术检测,结果提示EpCAM N-糖基化突变没有改变EpCAM的表达定位。将EpCAM N-糖基化突变质粒联合TGF-β1作用于乳腺癌细胞,结果发现EMT分子标记物E-钙粘蛋白(E-cadherin)表达量上升,N-钙粘蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimention)表达量下降。结果提示,EpCAM N-糖基化修饰调控乳腺癌细胞EMT发生。将EpCAM N-糖基化突变质粒联合TGF-β1和ERK1/2和PI3K/Akt的抑制剂作用于两种乳腺癌细胞。结果发现EMT分子标记物E-钙粘蛋白(E-cadherin)表达量上升,N-钙粘蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimention)表达量下降,ERK1/2和PI3K/Akt信号通路中p Raf-1、p ERK、p Akt表达量下降。结果表明,TGF-β1诱导下,EpCAM N-糖基化修饰经由MAPK/PI3K/Akt通路对乳腺癌细胞EMT存在抑制作用。综上所述,TGF-β1诱导下,EpCAM N-糖基化修饰通过MAPK和PI3K/Akt通路来调控乳腺癌细胞EMT。整合素作为细胞表面重要的粘附分子,参与细胞与细胞外基质的粘附过程,参与细胞内外的跨膜转导。从而参与细胞分裂、粘附、凋亡等生物特定行为的调控。细胞也可根据自身状态及需要调节整合素与配体的亲和力,影响细胞与细胞外基质的粘附及迁移。在乳腺癌细胞(MCF-7、MDA-MB-231)中瞬时转染EpCAM N-糖基化突变质粒处理48小时,实验结果表明,降低纤维连接蛋白(Fibronectin,FN)和integrinβ1蛋白表达,从而进一步激活由integrinβ1调节下游关键性的粘着斑激酶(Focal Adhension Kinase,FAK)同时,降低了p FAK、p Scr的蛋白表达。研究发现,FAK可以诱导PI3K/Akt信号通路的激活,采用FAK特异性抑制剂PF-573228联合EpCAM N-糖基化突变质粒作用于两种乳腺癌细胞中处理48小时,结果提示,PI3K/Akt信号通路中p Akt、p GSK3β、β-catenin和MMP-2/MMP-9蛋白表达量下降。因此,乳腺癌细胞中EpCAM N-糖基化修饰通过抑制integrinβ1和FN表达,通过PI3K/Akt信号通路,转录因子β-catenin调节MMP-2/MMP-9表达降低乳腺癌细胞与细胞外基质分子的粘附。综上所述,EpCAM N-糖基化修饰可以调控乳腺癌细胞EMT的发生和乳腺癌细胞与胞外基质分子的粘附。本实验阐明了乳腺癌细胞发生发展的过程中EpCAM N-糖基化修饰调控EMT的分子机制,并且为临床上乳腺癌的基因治疗方案的选择、基因治疗药物的开发提供科学依据。EpCAM作为靶点对乳腺癌的治疗,提供坚实的理论基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.9

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本文编号：1649583