脱氧胆酸介导的肠道菌群失衡促进肠腺瘤恶变的机制研究

发布时间：2018-03-23 07:16

本文选题：脱氧胆酸　切入点：肠道菌群　出处：《天津医科大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的肠癌是全世界最常见的肿瘤之一。抑癌基因腺瘤性息肉病基因(adenomatous polyposis coli gene,Apc)突变是肠癌形成多步骤过程中的早期事件。高脂饮食在改变肠道菌群的同时增加肠腔内脱氧胆酸(deoxycholic acid,DCA)的含量,而DCA水平持续升高与肠癌发生显著相关,然而肠道菌群与肠癌发生的因果关系尚未明确。本研究拟以肠腺瘤病小鼠模型Apc~(min/+)小鼠为研究对象,探讨DCA促进腺瘤恶变过程中肠道菌群的改变,运用菌群移植诱导肠腺瘤恶变并探索其机制。方法第一部分为探讨DCA促进Apc~(min/+)小鼠腺瘤恶变过程中肠道菌群改变,我们将4周龄野生型小鼠和Apc~(min/+)小鼠分为三组:野生型组(含0.2%DCA饮用水)、Apc~(min/+)对照组(常规饮食水)和Apc~(min/+)DCA组(简称DCA组)。实验0周和12周时收集新鲜粪便以行16S r RNA菌群检测。显微镜下观察并记录肠道腺瘤的数目、大小及分布情况。HE染色评估肠道肿瘤病理类型,免疫组化评估肿瘤细胞增殖情况,TUNEL技术评估肿瘤细胞凋亡。Realtime-PCR及免疫荧光评价肠道上皮紧密连接分子m RNA和蛋白变化。实验12周时予FITC-D以评价Apc~(min/+)小鼠肠上皮通透性。第二部分为探讨肠道菌群与肠癌发生的因果关系,将上述对照组和DCA组在实验12周后停止DCA干预(经2周DCA洗脱期),作为粪便供体。处理粪便制成粪菌液后以灌胃方式予实验各组小鼠(粪菌移植:FMT):FMT 1组(植入DCA组粪便的野生型小鼠)、FMT 2组(植入对照组粪便的Apc~(min/+)小鼠)、FMT3组(植入DCA组粪便的Apc~(min/+)小鼠)。各组小鼠于FMT前予链霉素预处理3天,8周实验周期内共行FMT 16次。收集实验8周时各组小鼠粪便检测菌群变化。评估FMT后肠道肿瘤生长及细胞增殖情况。Realtime-PCR检测FMT后肠粘膜炎性因子m RNA水平,同时检测粪菌液刺激后结肠肿瘤细胞分泌的炎性因子m RNA水平;并运用免疫荧光双染等方法评价FMT后肠道肿瘤微环境中单核-巨噬系统活化情况。免疫组化和Western blot方法检测TLR4/My D88和Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达情况。第三部分为进一步明确肠道菌群在肠癌发生中的重要作用,将4周龄Apc~(min/+)小鼠随机分为两组:DCA组和DCA联合抗生素组(抗生素:0.2 g/L氨苄西林、0.1 g/L万古霉素、0.2 g/L新霉素和0.2 g/L甲硝唑)。实验12周时处死小鼠,于解剖显微镜和HE染色观察肠道腺瘤生长及癌变情况。结果第一部分(1)实验12周后野生型组小鼠肠道未出现肿瘤,且肠道组织结构无明显异常。对照组全肠道散在小腺瘤,多为管状腺瘤,偶伴低级别上皮内瘤变;DCA组肠道腺瘤总数明显增多,以小肠中、远段及大肠腺瘤数目显著;肠道腺瘤成簇密集出现,部分结肠近端有巨大腺瘤生长;远段小肠及70%结肠腺瘤为粘膜内癌,余30%结肠腺瘤为高级别上皮内瘤变。同时DCA使肠道肿瘤细胞增殖明显增多,凋亡细胞数显著下降。(2)DCA使肠道菌群多样性明显降低,并使厚壁菌门/拟杆菌门比例失衡。DCA加重肠道菌群失衡,表现为实验12周较实验0周时肠道菌群构成中致病菌如梭菌属、脱硫弧菌属、埃希-志贺菌属等比例明显增高,而益生菌如乳酸杆菌属、瘤胃球菌属、毛螺旋菌等比例则降低。(3)DCA使肠组织炎性细胞因子基因表达水平显著上调。(4)DCA下调肠上皮紧密连接蛋白指标ZO-1及Claudin3基因表达水平;FITC-D示DCA使Apc~(min/+)小鼠肠上皮通透性显著增加。第二部分(1)FMT1组肠道无肿瘤发生。FMT3组肠道腺瘤总数明显增多,且72.7%(8/11)近段小肠腺瘤为粘膜内癌;肿瘤细胞增殖指标Ki-67阳性细胞数明显增多。(2)PCA分析显示FMT2组与FMT3组肠道微生物群落在PC2与PC3维度上具有差异。实验12周时FMT3组厚壁菌门/拟杆菌门下降,肠道菌群构成中致病菌如埃希-志贺菌属、副拟杆菌属、脱硫弧菌属、加式螺杆菌等明显增多,而益生菌如乳酸杆菌属、罗氏菌属、瘤胃球菌属、毛螺旋菌、柔嫩梭菌则明显降低。(3)DCA组粪菌液刺激IMCE和HT-29细胞系后,炎性细胞因子基因水平明显上调。FMT 3组肠组织炎性细胞因子、MCP-1及巨噬细胞F4/80显著增多;且肿瘤间质中M2型巨噬细胞表面分子比例增多,而M1型巨噬细胞表面分子比例减少。(4)FMT3组肠道TLR4及My D88表达明显上调、cadherin-E表达显著减弱,β-catenin出现核异位表达,cyclin D1表达增多。第三部分从整体水平上调控肠道菌群可削弱DCA诱导的Apc~(min/+)小鼠肠道肿瘤进展,表现为肿瘤数目减少、直径更小、癌变率降低。结论DCA介导的肠道微生态失衡可破坏肠粘膜屏障,诱导肠道低度炎症发生,通过激活单核-巨噬系统,使巨噬细胞发生M1至M2型极化,进而激活肿瘤相关信号通路促使肠腺瘤恶变。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.3

【相似文献】