FBXW7抑制胆管癌上皮—间质转化、干细胞特性及转移的作用及机制研究

发布时间：2018-03-24 02:27

本文选题：胆管癌　切入点：FBXW7　出处：《山东大学》2016年博士论文

【摘要】：胆管癌(Cholangiocarcinoma, CCA)起源于胆管上皮细胞,是肝胆系统中除肝癌以外最为常见的恶性肿瘤。根据解剖位置的不同胆管癌可分为肝内胆管癌(intrahepatic CCA, IHCC)..肝门部胆管癌(perihilar CCA,PHCC)及远端胆管癌(distal CCA, DCC).近期研究报道胆管癌的发病率及死亡率呈不断上升趋势。胆管癌侵袭性强、转移早,多于2／3的患者确诊时已失去手术机会,而且,胆管癌辅助治疗措施的效果尚需要进一步的验证。胆管癌患者总体中位生存时间仅15个月。因此,进一步明确胆管癌发生发展的分子机制、寻找胆管癌早期诊断指标及有效治疗靶点对改善患者预后具有十分重要的意义。FBXW7 (F-box and WD repeat domain containing 7)是F-box蛋白家族成员之一,Skpl-Cull-F box (SCF)泛素化连接酶复合体中的识别亚基。前期研究已证实FBXW7能够调节多种重要肿瘤蛋白的泛素化降解,如Notch、cyclin E1、 mTOR、c-Myc及c-Jun等；且其对诸多重要的细胞生物学过程具有调控作用,主要包括细胞增殖、分化、DNA损伤反应、基因组稳定性维持及细胞周期等。目前,FBXW7被视为一种重要的肿瘤抑制基因及潜在的肿瘤治疗靶点,但FBXW7在肿瘤转移中的作用研究很少,其在胆管癌中的功能尚需进一步明确。肿瘤转移是影响胆管癌患者预后最为重要的原因。越来越多的证据表明上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)与肿瘤转移密切相关。EMT的具体过程包括细胞之间粘附性消失、细胞去极化、细胞侵袭及迁移能力增强等,间质细胞形态利于肿瘤细胞向远处器官迁移及干细胞特性的维持,在肿瘤转移的起始及发展阶段有利于其向其他细胞类型转化。但EMT在胆管癌中的作用及机制研究较少。因此,进一步明确胆管癌EMT机制对于探索其转移机制具有重要价值。本研究主要探索FBXW7调控胆管癌EMT、干细胞特性以及转移的作用,并深入研究可能的分子机制。该研究不仅进一步明确了胆管癌转移的机制,也为探所胆管癌早期诊断指标及治疗靶点提供了新的证据。第一部分E3泛素化连接酶FBXW7与胆管癌临床病理特征的相关性研究[目的]检测胆管癌细胞株及三种类型的胆管癌标本中FBXW7的表达,并分析FBXW7与胆管癌临床病理特征之间的相关性,明确FBXW7在胆管癌中的临床意义,同时为探索FBXW7在胆管癌中的功能奠定基础。[方法]1.应用胆管正常上皮细胞、肝内胆管癌及肝门部胆管癌细胞株,经qRT-PCR和Western blot检测各细胞株中FBXW7 mRNA和蛋白表达水平。2.收集山东大学齐鲁医院普外科手术切除胆管癌及对应癌旁新鲜组织,经Western blot检测胆管癌及癌旁组织中FBXW7蛋白表达水平。3.收集山东大学齐鲁医院普外科手术切除肝内胆管癌及癌旁石蜡组织,并制成石蜡组织切片,经免疫组织化学染色检测肝内胆管癌癌旁组织、无转移的胆管癌组织及有转移的胆管癌组织中的FBXW7蛋白表达水平,并统计分析其与肿瘤大小、转移、分化程度及TNM分期之间的关系。4.收集山东大学齐鲁医院普外科手术切除肝门部胆管癌及癌旁石蜡组织,并制成石蜡组织切片,经免疫组织化学染色检测肝门部胆管癌癌旁组织、无转移的胆管癌组织及有转移的胆管癌组织中的FBXW7蛋白表达水平,并统计分析其与肿瘤大小、转移、分化程度及TNM分期之间的关系。5.收集山东大学齐鲁医院普外科手术切除远端胆管癌及癌旁石蜡组织,并制成石蜡组织切片,经免疫组织化学染色检测远端胆管癌癌旁组织、无转移的胆管癌组织及有转移的胆管癌组织中的FBXW7蛋白表达水平,并统计分析其与肿瘤大小、转移、分化程度及TNM分期之间的关系。[结果]1. qRT-PCR和Western blot结果显示正常胆管上皮细胞(HIBEpic)中FBXW7 mRNA和蛋白水平明显高于肝内胆管癌细胞(HuCCT1和RBE)及肝门部胆管癌细胞(QBC939和FRH0201)。2.收集7例胆管癌及对应癌旁新鲜组织,Western blot结果显示其中6例胆管癌癌旁组织中FBXW7表达明显高于胆管癌组织。3.通过免疫组织化学染色检测肝内胆管癌癌旁组织、无转移的胆管癌组织及有转移的胆管癌组织中的FBXW7蛋白表达水平,结果表明肝内胆管癌癌旁组织中FBXW7表达最高,无转移的胆管癌中表达较高,而具有转移灶的胆管癌中FBXW7的表达最低；统计学分析显示FBXW7表达与肝内胆管癌肿瘤大小、转移、分化程度及TNM分期明显相关。4.通过免疫组织化学染色检测肝门部胆管癌癌旁组织、无转移的胆管癌组织及有转移的胆管癌组织中的FBXW7蛋白表达水平,结果表明肝门部胆管癌癌旁组织中FBXW7表达最高,无转移的胆管癌中表达较高,而具有转移灶的胆管癌中FBXW7的表达最低；统计学分析显示FBXW7表达与肝门部胆管癌转移、分化程度及TNM分期明显相关。5.通过免疫组织化学染色检测远端胆管癌癌旁组织、无转移的胆管癌组织及有转移的胆管癌组织中的FBXW7蛋白表达水平,结果表明各组间FBXW7表达无明显差异；统计学分析显示FBXW7表达与远端胆管癌肿瘤大小、转移、分化程度及TNM分期无明显相关性。[结论]1.FBXW7在胆管正常上皮细胞中表达量明显高于肝内胆管癌细胞及肝门部胆管癌细胞,且FBXW7在胆管癌癌旁组织中表达明显高于胆管癌组织,提示FBXW7在胆管癌中为抑癌基因。2. FBXW7可抑制肝内胆管癌及肝门部胆管转移,且与肿瘤分化程度及TNM分期明显相关。第二部分FBXW7调控胆管癌上皮-间质转化、干细胞特性及转移的作用研究[目的]上述临床研究结果表明FBXW7可抑制胆管癌转移,且与肝内胆管癌及肝门部胆管癌分化程度及TNM分期明显相关。本部分通过体外细胞实验和体内裸鼠转移模瘤型进一步检测FBXW7在胆管癌EMT、干细胞特性和转移中的作用。[方法]1.构建FBXW7干扰质粒(pBabe-shFBXW7.1及pBabe-shFBXW7.2),经逆转录病毒转染pBabe-shFBXW7.1、pBabe-shFBXW7.2及其空白对照质粒,使用FBXW7基础表达水平相对较高的HuCCT1细胞和RBE细胞构建FBXW7稳定低表达的细胞株及其对照组细胞。通过qRT-PCR和Western blot检测所构建的稳定转染细胞系中FBXW7 mRNA及蛋白表达水平。2.构建FBXW7高表达质粒(pBabe-FBXW7),经逆转录病毒转染pBabe-FBXW7及其空白对照质粒,使用FBXW7基础表达水平相对较低的QBC939细胞和FRH0201细胞构建FBXW7稳定过表达的细胞株及其对照组细胞。通过qRT-PCR和Western blot检测所构建的稳定转染的细胞系中FBXW7 mRNA及蛋白表达水平。3.应用FBXW7稳定低表达及高表达细胞株,普通光学显微镜观察FBXW7表达改变对细胞表型的影响；经Western blot检测EMT相关标志分子(E-cadherin、 α-catenin、Fibronectin及Vimentin)的表达水平改变,验证FBXW7对胆管癌EMT的调控作用。4.应用FBXW7稳定低表达及高表达细胞株,通过Western blot检测其干细胞特性标志分子(Nanog、OCT4)的表达；经Primary sphere formation及Secondary sphere formation实验检测干细胞自我更新能力,验证FBXW7对胆管癌干细胞特性的调控作用。5.应用FBXW7稳定低表达及高表达细胞株,通过细胞划痕实验、Transwell小室细胞迁移实验检测FBXW7在调控胆管癌细胞迁移能力中的作用；经Matrigel侵袭实验检测FBXW7在调控胆管癌细胞侵袭能力中的作用。6.收集山东大学齐鲁医院普外科手术切除肝内胆管癌及癌旁石蜡组织,并制成石蜡组织切片,经免疫组织化学染色检测肝内胆管癌癌旁组织、无转移的胆管癌组织及有转移的胆管癌组织中的E-cadherin蛋白表达水平,并统计分析其与对应标本中FBXW7表达之间的相关性。7.收集山东大学齐鲁医院普外科手术切除肝门部胆管癌及癌旁石蜡组织,并制成石蜡组织切片,经免疫组织化学染色检测肝门部胆管癌癌旁组织、无转移的胆管癌组织及有转移的胆管癌组织中的E-cadherin蛋白表达水平,并统计分析其与对应标本中FBXW7表达之间的相关性。8.应用FBXW7稳定低表达和高表达的细胞及其对照组细胞建立裸鼠转移瘤模型,观察肿瘤转移情况；通过HE染色检测肺脏及肝脏组织中转移灶数量,经体内实验验证FBXW7能否抑制胆管癌细胞转移。9.经免疫组织化学染色方法检测各组裸鼠肺脏及肝脏转移灶中FBXW7及E-cadherin表达情况,经体内实验验证FBXW7在胆管癌EMT中的调控作用。[结果]1.成功构建pBabe-shFBXW7.1及pBabe-shFBXW7.2质粒,并稳定转染HuCCTl细胞和RBE细胞(分别命名为HuCCT1-Vector、HuCCT1-shFBXW7.1、 HuCCT1-shFBXW7.2; RBE-Vector、RBE-shFBXW7.1、RBE-shFBXW7.2)。经qRT-PCR和Western blot险测证实FBXW7低表达稳定转染细胞系构建成功。2.成功构建pBabe-FBXW7质粒,并稳定转染QBC939细胞和FRH0201细胞(分别命名为QBC939-Vector、QBC939-FBXW7; FRH0201-Vector、FRH0201-FBXW7)。经qRT-PCR和Western blot检测证实FBXW7高表达稳定转染细胞系构建成功。3.普通光学显微镜观察显示FBXW7能够抑制胆管癌细胞由上皮细胞形态向间质细胞形态转化。Western blot证实FBXW7能够促进上皮细胞标志分子E-cadherin和α-catenin的表达,同时抑制间质细胞标志分子Fibronectin和Vimentin的表达。4. Western blot证实FBXW7能够抑制干细胞特性标志分子Nanog和OCT4的表达；Primary sphere formation及Secondary sphere formation实验证实FBXW7能够抑制胆管癌干细胞自我更新能力。5.经划痕实验、 Transwell小室迁移实验及Matrigel侵袭实验证实FBXW7能够抑制胆管癌细胞体外迁移和侵袭能力。6.统计学分析提示在肝内胆管癌中E-cadherin表达与肿瘤转移呈明显负相关,且其表达量与FBXW7呈正相关。7.统计学分析提示在肝门部胆管癌中E-cadherin表达与肿瘤转移呈明显负相关,且其表达量与FBXW7呈正相关。8.体内实验证实FBXW7可抑制胆管癌细胞转移能力。9.体内实验证实FBXW7可抑制胆管癌EMT。[结论]1.体内外实验证实FBXW7可抑制胆管癌EMT。2.体外实验证实FBXW7可抑制胆管癌细胞干细胞特性。3.体内外实验证实FBXW7能够抑制胆管癌细胞的迁移和侵袭能力。第三部分FBXW7抑制胆管癌上皮-间质转化、干细胞特性及转移的分子机制研究[目的]上述研究经体内外实验已经证实FBXW7能够通过抑制胆管癌EMT及干细胞特性进而抑制其转移。本部分将对FBXW7抑制胆管癌EMT的具体分子机制进行进一步探索。[方法]1.检测FBXW7高表达和低表达的细胞中mTOR及p-mTOR表达量,结合前期文献报道,明确FBXW7在胆管癌细胞中是否能够泛素化降解mTOR。2.应用mTOR特异性抑制剂rapamycin处理FBXW7低表达的细胞,经Western blot检测EMT标志分子(E-cadherin、Vimentin)表达变化：经Primary sphere formation及Secondary sphere formation实验检测胆管癌干细胞自我更新能力改变；经划痕实验、Transwell小室迁移实验检测细胞迁移能力变化,细胞侵袭能力变化经Matrigel侵袭实验检测验证。3.应用]mTOR特异性抑制剂rapamycin处理FBXW7低表达的细胞,经qRT-PCR及Western blot检测EMT转录调控因子(Snail、Slug及ZEB1) mRNA水平及蛋白水平改变,进一步分析FBXW7调控胆管癌EMT的分子机制。4.筛选最有意义的EMT转录调控因子,首先检测其在胆管癌细胞中的表达情况；应用胆管癌细胞及FBXW7低表达的胆管癌细胞,shRNA干扰技术沉默所筛选EMT转录调控因子,经Western blot检测EMT标志分子(E-cadherin、Vimentin)表达变化；同时经划痕实验、Transwell小室迁移实验检测细胞迁移能力变化,细胞侵袭能力变化经Matrigel侵袭实验检测验证。5.收集山东大学齐鲁医院普外科手术切除肝内胆管癌及癌旁石蜡组织,并制成石蜡组织切片,经免疫组织化学染色检测肝内胆管癌癌旁组织、无转移的胆管癌组织及有转移的胆管癌组织中所筛选EMT转录调控因子蛋白表达水平,并统计分析其与对应标本中E-cadherin及FBXW7表达之间的相关性。6.收集山东大学齐鲁医院普外科手术切除肝门部胆管癌及癌旁石蜡组织,并制成石蜡组织切片,经免疫组织化学染色检测肝门部胆管癌癌旁组织、无转移的胆管癌组织及有转移的胆管癌组织中的所筛选EMT转录调控因子蛋白表达水平,并统计分析其与对应标本中E-cadherin及FBXW7表达之间的相关性。7.对FBXW7稳定低表达细胞建立的裸鼠转移瘤模型腹腔注射rapamycin,观察肿瘤转移情况；HE染色检测肺脏及肝脏组织中转移灶数量,并与未用药组比较,经体内实验验证mTOR能否介导FBXW7调控胆管癌转移。8.对FBXW7稳定低表达细胞建立的裸鼠转移瘤模型腹腔注射rapamycin,免疫组织化学染色检测肝脏及肺脏转移灶中FBXW7及E-cadherin表达水平,并与未用药组比较,经体内实验验证mTOR能否介导FBXW7调控胆管癌EMT。[结果]1.经Western blot检测证实胆管癌细胞中FBXW7表达量与mTOR及p-mTOR呈负相关,结合前期报道,证实FBXW7在胆管癌细胞中可泛素化降解mTOR。2.经Western blot检测证实rapamycin可逆转FBXW7沉默引起的上皮细胞标志分子(E-cadherin)表达降低及间质细胞标志分子(Vimentin)表达升高；经Primary sphere formation及Secondary sphere formation实验证实rapamycin能够逆转FBXW7沉默引起的胆管癌干细胞自我更新能力增强；经划痕实验、Transwell小室迁移实验及Matrigel侵袭实验证实rapamycin能够逆转FBXW7沉默引起的胆管癌细胞体外迁移和侵袭能力增强。3.经qRT-PCR及Western blot检测证实rapamycin能够逆转FBXW7沉默引起的EMT转录调控因子Snail、Slug及ZEB1的表达增强。4.ZEB1在胆管癌中的功能尚未见报道,本研究中首先检测了ZEB1在胆管癌中的表达水平及在胆管癌转移、EMT中的作用,并进一步检测了ZEB1在FBXW7/mTOR信号通路调控胆管癌EMT及转移中的作用。RT-PCR及Western blot证实在胆管癌细胞中ZEB1 mRNA及蛋白表达水平明显高于正常胆管上皮细胞。在胆管癌细胞及FBXW7低表达的胆管癌细胞中转染pSingle-shZEB1.1、 pSingle-shZEB1.2及pSingle-Vector质粒,经Western blot检测证实ZEB1干扰后可逆转FBXW7沉默引起的上皮细胞标志分子(E-cadherin)表达降低及间质细胞标志分子(Vimentin)表达升高；经划痕实验、Transwell小室迁移实验及Matrigel侵袭实验证实ZEB1干扰能够逆转FBXW7沉默引起的胆管癌细胞体外迁移和侵袭能力增强。5.统计学分析提示在肝内胆管癌中ZEB1表达与肿瘤转移明显相关,且其表达量与E-cadherin及FBXW7呈负相关。6.统计学分析提示在肝门部胆管癌中ZEB1表达与肿瘤转移明显相关,且其表达量与E-cadherin及FBXW7呈负相关。7.体内实验证实rapamycin能够明显逆转FBXW7沉默引起胆管癌细胞转移能力增强。8.体内实验证实rapamycin能够明显逆转FBXW7沉默引起的EMT。[结论]1.mTOR可介导FBXW7抑制胆管癌细胞EMT、干细胞特性及转移的作用。2.ZEB1可介导FBXW7/mTOR通路对胆管癌细胞EMT和转移的调控作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.8

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