PGRN 在结直肠癌中的作用及分子机制研究

发布时间：2018-03-24 10:48

  本文选题：结直肠癌　切入点：PGRN　出处：《山东大学》2016年博士论文

【摘要】：研究背景结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是目前常见的胃肠道恶性肿瘤,占所有恶性肿瘤的10%-15%,其病死率在全球所有肿瘤中高居第三位。近年来,随着科技的不断发展,手术、化疗、放疗等传统的肿瘤治疗手段得到了很大的改进,分子靶向治疗及生物治疗等新兴治疗手段也取得了进一步的发展,CRC患者的总生存率得到了一定程度的改善,但是,进展期CRC患者的预后仍不理想。因此,寻找有效靶点抑制CRC进展仍面临巨大挑战。肿瘤进展是肿瘤细胞和肿瘤微环境相互作用、相互促进的过程,肿瘤血管生成和间质成纤维细胞活化是肿瘤微环境中重要的促肿瘤因素。肿瘤细胞通过与间质细胞的直接接触,或者通过分泌血管内皮生长因子-A (VEGF-A)、转化生长因子-β (TGF-p)、血管内皮生长因子-C (VEGF-C)等细胞因子,激活血管内皮细胞和间质成纤维细胞内信号通路,调节血管内皮细胞和间质成纤维细胞的增殖、迁移能力,诱导间质成纤维细胞高表达成纤维细胞活化蛋白(FAP)、平滑肌肌动蛋白α(α-SMA),从而促进肿瘤血管生成和间质成纤维细胞的活化。肿瘤血管既通过输送营养物质满足了肿瘤细胞生长的需要,又通过血液循环为肿瘤细胞的播散和转移创造了条件；活化的成纤维细胞通过调节肿瘤细胞的上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition, EMT)等过程促进了肿瘤细胞的迁移、侵袭、耐药等恶性生物学特性。因此,寻找能抑制肿瘤细胞生长、血管生成和间质成纤维细胞活化的靶点,将为CRC患者提供更有效的治疗手段。颗粒蛋白前体(Progranulin, PGRN)基因位于人17号染色体,编码区由12个外显子(Ⅰ-Ⅻ)构成。PGRN蛋白分子量为68.5kDa,经糖基化修饰后分子量为90kDa,是由7.5个富含丝氨酸的串联重复序列结构域组成的分泌性糖蛋白,广泛表达于免疫细胞、神经元、上皮细胞及软骨细胞等,在介导创伤愈合、抑制神经退行性变及软骨形成方面发挥了重要作用。近年来的研究发现PGRN在乳腺癌、卵巢癌、肝癌等肿瘤的增殖、耐药、迁移、侵袭中发挥了重要的作用,但其在CRC增殖和血管生成中的作用尚未见报道。除了对肿瘤细胞的作用,有研究发现骨髓间充质细胞来源的PGRN可以激活小鼠乳腺间质成纤维细胞,促进乳腺癌细胞的生长：在小鼠皮肤损伤修复过程中,损伤局部高浓度PGRN的聚集,促进了成纤维细胞的增殖和迁移,参与组织的修复和重塑。然而,人CRC细胞来源的PGRN是否可以促进间质成纤维细胞的活化尚不清楚。肿瘤坏死因子受体2(tumor necrosis factor receptor 2, TNFR2)是肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族成员,分为可溶型(sTNFR2)和膜结合型(mTNFR2),在多种肿瘤中高表达,并参与了肿瘤的增殖、侵袭和转移等过程。尽管研究发现病人血液中sTNFR2的水平高低与患CRC的风险密切相关,但CRC组织中TNFR2的临床相关性尚不清楚。研究发现PGRN可以通过TNFR2抑制肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor a, TNF-a)介导的急性肺损伤中中性粒细胞的活化和小鼠类风湿关节炎中的炎症反应。但是,PGRN是否可以通过TNFR2促进肿瘤进展尚不清楚,PGRN对TNFR2表达的调节作用亦未见报道。研究目的明确PGRN与CRC患者临床参数和预后的相关性；检测PGRN对CRC增殖和血管生成的作用；检测CRC中PGRN对间质成纤维细胞活化的作用；明确PGRN发挥以上作用的分子机制；明确TNFR2与CRC患者临床参数和预后的相关性,并进一步研究PGRN对TNFR2表达的调节作用,以期为CRC的治疗提供新的靶点。研究方法1.免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)检测PGRN在CRC组织和正常结直肠组织中的表达,并进一步分析CRC组织中PGRN表达与患者临床参数及预后的关系；RT-PCR, Western blot, ELISA检测PGRN在人CRC细胞系和人正常肠上皮细胞系中的表达。2.用p-GPU6/GFP/Neo/PGRN质粒或空载体转染CRC细胞SW480、SW1116和HT29,获得干扰PGRN表达的CRC细胞株SW480-PGRN-sh、SW1116-PGRN-sh、 HT29-PGRN-sh及对照细胞株SW480-NC-sh、SW1116-NC-sh、HT29-NC-sh;用pEZ-M61/GFP/PGRN质粒或空载体转染CRC细胞SW480、SW1116,获得过表达PGRN的细胞株SW480-PGRN-vector、SW1116-PGRN-vector及对照细胞株SW480-NC-vector、SW1116-NC-vector。RT-PCR、Western blot确定转染效率。3.IHC检测增殖指标Ki67在CRC组织的表达,并分析与PGRN的相关性；上调/下调SW1116细胞PGRN表达后,RT-PCR、Western blot检测Ki67、抗凋亡指标Bcl-2表达变化；MTT检测细胞生长变化；流式细胞术检测细胞凋亡变化。下调HT29细胞PGRN表达后,MTT检测细胞生长变化。检测PGRN重组蛋白对SW1116细胞Ki67表达的影响。4.IHC检测VEGF-A、血管内皮细胞标记分子CD34在CRC中的表达,并分析PGRN与VEGF-A表达和微血管密度(MVD)的相关性；上/下调SW1116细胞PGRN表达后,检测VEGF-A、成纤维细胞生长因子1 (FGF1)、VEGF-C表达的变化；检测PGRN重组蛋白对SW1116细胞VEGF-A表达的影响；检测SW1116-PGRN-vector细胞条件培养基或PGRN重组蛋白对人脐静脉内皮细胞(HUVEC) Ki67. VEGF-A表达及增殖、迁移、成管能力的影响。5. Western blot检测PGRN对SW1116细胞细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinases, ERK)、蛋白激酶B (protein kinase B,PKB or AKT)、P38磷酸化水平的影响,并筛选出PGRN下游通路靶点ERK、AKT;加入ERK或AKT通路阻滞剂后,检测PGRN诱导的Ki67、VEGF-A表达的变化,以明确PGRN是否通过ERK、AKT通路调节Ki67、VEGF-A的表达；加入TNFR2中和抗体,检测PGRN诱导的SW1116细胞中Ki67、VEGF-A、p-ERK、p-AKT的变化,以明确TNFR2在PGRN对CRC细胞Ki67、VEGF-A表达调节中的作用。加入TNFR2中和抗体,检测SW1116-PGRN-vector细胞条件培养基或PGRN重组蛋白诱导的HUVEC细胞Ki67、VEGF-A、p-ERK、p-AKT表达的变化,以明确TNFR2在PGRN诱导HUVEC细胞血管形成能力中的作用。6.将CRC细胞SW480、SW1116与结肠间质成纤维细胞CCD-18Co同时均匀铺种于六孔板中,设固定时间点观察细胞贴壁情况,比较贴壁时间的差异；将SW480或SW1116细胞与CCD-18Co细胞共培养,根据贴壁时间的差异分离获得成纤维细胞,分别命名为CCD-18Co/SW480细胞或CCD-18Co/SW1116细胞,通过检测上皮标记E-cadherin和成纤维细胞活化标记α-SMA的表达验证分离后成纤维细胞的纯度。7.IHC染色并分析CRC细胞中PGRN表达与间质中α-SMA表达的相关性：将SW480-NC-sh、SW480-PGRN-sh分别与CCD-18Co细胞共培养,分离后检测CCD-18Co、CCD-18Co/SW480-NC-sh及CCD-18Co/SW480-PGRN-sh细胞中Ki67、FAP、 α-SMA的表达差异；MTT检测增殖能力变化；Transwell小室检测迁移能力变化；凝胶收缩实验检测收缩能力变化。同样方法检测SW1116细胞中PGRN变化对共培养的成纤维细胞中Ki67、FAP、α-SMA表达的影响。PGRN重组蛋白处理CCD-18Co细胞,进一步观察PGRN对成纤维细胞增殖能力、迁移能力、收缩能力的影响。8.分别与SW480-NC-sh、SW480-PGRN-sh细胞共培养后,检测CCD-18Cα、 CCD-18Co/sW480-NC-sh、CCD-18Co/SW480-PGRN-sh细胞中ERK、AKT、P38、JNK磷酸化水平的差异；PGRN重组蛋白处理后,检测CCD-18Co细胞ERK、AKT、 P38、JNK磷酸化水平变化,筛选出PGRN下游通路靶点ERK、AKT;加入ERK或AKT通路阻滞剂,检测PGRN重组蛋白诱导的CCD-18Co细胞Ki67、FAP、 α-SMA蛋白表达变化,明确PGRN是否通过ERK、AKT通路调节成纤维细胞Ki67、TAP、α-SMA蛋白表达变化。加入TNFR2中和抗体后,检测PGRN重组蛋白诱导的CCD-18Co细胞中Ki67、FAP、α-SMA、p-ERK、p-AKT表达及细胞增殖、迁移、收缩能力的变化。9.IHC检测CRC组织中TNFR2的表达,分析其与CRC患者临床参数及预后的相关性,并分析与PGRN表达的相关性；通过转染上调／下调SW480细胞、SW1116细胞PGRN的表达,检测TNFR2表达的变化：用PGRN重组蛋白处理SW480细胞、SW1116细胞,检测TNFR2表达的变化；上调PGRN表达或PGRN重组蛋白处理后,检测SW480细胞、SW1116细胞p-ERK、p-AKT、p-P38的变化；加入ERK阻滞剂U0126或AKT阻滞剂LY294002后,检测SW480细胞、SW1116细胞TNFR2表达的变化。研究结果1. PGRN在CRC中高表达,并与患者临床分期、淋巴结转移及不良预后密切相关IHC检测显示PGRN在CRC组织(77例)中的表达明显强于正常结直肠组织(20例)中的表达(P=0.000),且PGRN表达与临床分期进展(P=0.021)和淋巴结转移(P=0.046)呈正相关,与患者无病生存期(DFS)呈明显负相关(P=0.042); RT-PCR、Western blot ELISA检测结果均显示：CRC细胞系(SW480、 SW1116、HT29)中PGRN的表达均明显强于正常肠上皮细胞系(FHC)中的表达。2. PGRN促进了CRC增殖IHC检测显示：CRC组织中PGRN表达与Ki67的表达呈明显正相关(P=0.002)；上调SW1116细胞PGRN表达后,Ki67蛋白表达明显升高,细胞增殖能力明显增强；下调SW1116细胞PGRN表达后,Ki67 mRNA和蛋白表达均明显降低,Bcl-2 mRNA表达明显降低,细胞增殖能力明显降低；下调HT29细胞PGRN表达后,细胞增殖能力亦明显降低；另外,PGRN重组蛋白促进了SW1116细胞Ki67蛋白表达。3. PGRN促进了CRC血管生成IHC检测显示：CRC组织中PGRN表达与VEGF-A表达(P=0.001)、MVD(P=0.006)呈明显正相关；上调SW1116细胞PGRN表达后,VEGF-A、 VEGF-C、FGF1蛋白表达明显升高,ELISA检测显示上清中VEGF-A表达亦明显升高；下调SW1116细胞PGRN表达后,VEGF-A、VEGF-C、FGF1蛋白表达明显降低,ELISA检测显示上清中VEGF-A表达亦明显降低；PGRN重组蛋白亦明显促进了SW1116细胞VEGF-A蛋白的表达；另外,SW1116-PGRN-vector细胞条件培养基和PGRN重组蛋白均明显促进了HUVEC细胞Ki67、VEGF-A的蛋白表达,增强了HUVEC细胞增殖、迁移、成管能力。4. PGRN通过TNFR2/AKT和ERK通路促进了CRC细胞Ki67、VEGF-A的表达和HUVEC的血管形成能力上调PGRN表达或用PGRN重组蛋白处理后,SW1116细胞ERK、AKT磷酸化水平明显升高；加入ERK阻滞剂U0126或AKT阻滞剂LY294002后,PGRN诱导的Ki67. VEGF-A表达被明显抑制；加入TNFR2中和抗体,PGRN诱导的Ki67、VEGF-A、p-AKT被明显抑制；加入TNFR2中和抗体,SW1116-PGRN-vector细胞条件培养基或PGRN重组蛋白诱导的HUVEC细胞中Ki67、EGF-A、p-AKT的表达均被明显抑制。5.共培养后成纤维细胞分离及纯度鉴定镜下观察发现：CCD-18C。细胞在30分钟时已贴壁,SW480、SW1116细胞在90分钟时才开始贴壁,贴壁时间差异明显；与SW480细胞共培养,分离后得到成纤维细胞CCD-18Co/sw480并进行纯度验证：免疫细胞化学(ICC)检测发现上皮标记分子E-cadherin在SW480细胞上染色明显,而CCD-18Co/sw480细胞成纤维细胞活化标记分子a-SMA染色明显,未见E-cadherin显色；Western blot检测同样发现SW480细胞E-cadherin表达明显,未检测到a-SMA表达,而CCD-18Co/sw480细胞a-SMA表达明显,未检测到E-cadherin表达。6.CRC细胞来源的PGRN促进了成纤维细胞的增殖、迁移、收缩能力IHC结果显示：a-SMA在CRC间质中染色明显,CRC细胞中PGRN表达与间质中a-SMA表达呈明显正相关(P=0.013)。与改变PGRN表达的SW480细胞共培养后,相对于CCD-18C0细胞,共培养后的CCD-18CO/sw480-NC-sh细胞Ki67、FAP、α-SMA蛋白表达均明显升高；细胞增殖、收缩能力亦明显增强。相对于CCD-18Co/sw480-NC-sh细胞,CCD-18Co/sw480-PGRN-sh细胞Ki67、FAP、α-SMA蛋白表达均明显降低；细胞增殖、迁移、收缩能力亦明显减弱。与改变PGRN表达的SW1116细胞共培养后,相对于CCD-18C。细胞,共培养后的CCD-18Co/SW1116-NC-sh细胞Ki67、FAP、α-SMA蛋白表达均明显升高；相对于CCD-18Co/SW1116-NC-sh细胞,CCD-18Co/SW1116-PGRN-sh细胞Ki67、FAP、α-SMA蛋白表达均明显降低。PGRN重组蛋白处理CCD-18Co细胞后,Ki67、FAP、α-SMA蛋白表达亦明显升高；细胞增殖、迁移、收缩能力亦明显增强。7. TNFR2/AKT和ERK信号通路参与了PGRN对成纤维细胞活化的调节与CCD-18Co细胞相比,共培养后的CCD-18CO/sW480-NC-sh细胞ERK. AKT磷酸化水平明显升高；与CCD-18Co/sw480-NC-sh细胞相比,CCD-18Co/sw480-PGRN-sh细胞ERK、AKT磷酸化水平明显降低。PGRN重组蛋白处理CCD-18Co细胞后,ERK、AKT磷酸化水平明显升高；分别加入ERK阻滞剂U0126或AKT阻滞剂LY294002后,PGRN重组蛋白诱导的CCD-18Co细胞中Ki67、FAP蛋白的上调被明显抑制,但a-SMA蛋白表达无变化；加入TNFR2中和抗体后,PGRN重组蛋白诱导的CCD-18Co细胞中Ki67、FAP、α-SMA、p-AKT的上调均被明显抑制；细胞增殖、迁移、收缩能力的增强亦被明显抑制。8. TNFR2在CRC中高表达,并与患者年龄、肿瘤大小及不良预后密切相关IHC检测显示CRC组织中TNFR2表达明显高于正常结直肠组织(P=0.000),CRC组织中TNFR2与患者年龄(P=0.011)、肿瘤大小(P=0.022)和无病生存期(DFS) (P=0.037)密切相关。9. PGRN通过AKT信号通路促进CRC细胞TNFR2的表达IHC检测发现TNFR2与PGRN表达呈明显正相关(P=0.006)；上调PGRN表达后,SW480细胞、SW1116细胞中TNFR2蛋白表达明显升高；下调PGRN表达后,SW480细胞、SW1116细胞中TNFR2蛋白表达明显降低；PGRN重组蛋白处理后,SW480细胞、SW1116细胞中TNFR2蛋白表达明显升高：上调PGRN表达或PGRN重组蛋白处理后,SW480细胞、SW1116细胞中p-ERK、p-AKT表达水平均明显升高；加入AKT阻滞剂LY294002, PGRN诱导的TNFR2表达上调被明显抑制。结论1. PGRN在CRC中高表达,并与CRC的进展和不良预后密切相关。2. PGRN通过TNFR2/AKT和ERK信号通路促进了CRC的增殖和血管生成。3. PGRN通过TNFR2/AKT和ERK信号通路促进了CRC间质成纤维细胞的活化。4. TNFR2在CRC组织中高表达,并与CRC的进展和不良预后密切相关。5. PGRN可以通过AKT信号通路促进CRC细胞TNFR2的表达
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.34
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本文编号：1657976