HP1γ在结直肠癌中的作用及其调控机制研究

发布时间：2018-03-24 16:54

  本文选题：HP1γ　切入点：结直肠癌　出处：《南京大学》2016年博士论文

【摘要】：结直肠癌(CRC)是世界范围内常见的恶性肿瘤之一,其发病率及死亡率均居恶性肿瘤的第3位。在我国,结直肠癌的发病率居恶性肿瘤的第3位,死亡率居恶性肿瘤的第5位。随着人民生活水平的提高和生活方式的转变,其发病率呈逐年上升的趋势,极大的威胁着人类健康,其主要原因在于人们对结直肠癌发病分子机制方面的研究一直没有取得重大的突破。因此,深入研究结直肠癌发病的分子机制,对结直肠癌早期诊断、临床治疗及预后都有着重要的意义。异染色质蛋白1-g(Heterochromatin protein 1-g,HP1γ)属于异染色质蛋白家族成员,由CBX3(Chromobox homolog 3)基因编码。作为染色质的特殊形式,HP1γ在很多生物学过程中发挥重要作用,例如异染色质的形成与基因沉默、DNA损伤修复、RNA剪接、转录激活、干细胞分化以及体细胞的重编程过程等。鉴于其分布广泛性,以及在基因调节中的不同作用,HP1γ很可能密切地参与了肿瘤的发生和发展过程。然而,HP1γ在结直肠癌中的作用机制尚不明确,有待深入研究阐明。为了解HP1γ在结直肠癌中的表达情况,我们首先在Oncomine数据库中对HP1γ表达情况进行了初步分析,分析结果表明HP1γ在结直肠癌组织中表达上调。为了验证这一结果,我们制备了包含180例结直肠癌标本及配对的癌旁正常对照的组织芯片,随后利用免疫组织化学染色检测了HP1γ蛋白在180例结直肠癌组织中的表达情况,并详细分析了HP1γ的表达与患者性别、年龄、肿瘤尺寸、位置、分化程度、转移和TNM分期等临床病理参数之间的关系。结果显示在结直肠癌组织中HP1γ蛋白表达水平显著高于正常组织(n=178,P0.001),并且发现HP1γ的表达与肿瘤分化程度呈显著负相关(P0.05)。随后,我们运用Kaplan-Meier法分析了180例结直肠癌患者的生存数据,并用Log-Rank检验分析比较了HP1γ高表达和低表达二者之间生存曲线的差异。结果显示,HP1γ的表达水平与结直肠癌患者的生存率之间呈负相关,在统计学上有非常显著的差异(P=0.001)。另外,在38例新鲜结直肠癌组织标本中,我们通过Western blot和Real-time PCR实验再次证实HP1γ蛋白和mRNA表达水平显著高于其配对的癌旁正常组织(P0.01)。鉴于HP1γ在结直肠癌中的表达情况,我们推测HP1γ在结直肠癌中可能扮演促癌基因的角色。为了验证这一推测,我们对HP1γ在结直肠癌细胞中的生物学功能进行了深入详细的研究。我们通过CCK-8、EdU、平板克隆形成、Transwell、划痕愈合、流式细胞周期与凋亡、裸鼠皮下成瘤实验分析检测了HP1γ表达沉默后对结直肠癌细胞增殖、克隆形成、转移、细胞周期与凋亡、体内成瘤能力的影响。结果表明,HP1γ表达沉默后结直肠癌细胞增殖、克隆形成及体内成瘤能力被抑制,但对转移能力没有显著影响。而且,流式细胞周期分析结果也显示HP1γ表达沉默后会导致结直肠癌细胞被阻滞在G1期,这暗示着HP1γ可能通过细胞周期相关的蛋白来调节细胞增殖,也进一步表明HP1γ在结直肠癌中扮演促癌基因的角色,暗示着HP1γ有可能成为将来治疗结直肠癌的一个新的靶点。随后,通过Real-time PCR实验我们对HP1γ表达沉默后细胞增殖和周期调控相关的一些关键基因进行了检测,结果发现HP1γ表达沉默后会导致p21~(Waf1/Cip1) mRNA(P0.01)和蛋白水平显著上调。p21~(Waf1/Cip1)是一个抑癌基因,是细胞周期G1/S转换的负调控因子。为了弄清HP1γ是否结合在p21~(Waf1/Cip1)基因启动子上来调节其表达,我们利用染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,Ch IP)技术分析了HP1γ在p21~(Waf1/Cip1)基因启动子上的结合情况。我们在p21~(Waf1/Cip1)基因启动子上不同位点设计引物进行Real-time PCR分析,结果表明,HP1γ在p21~(Waf1/Cip1)基因启动子-297~-191处结合最强,但在更远的启动子区域如-2596~-2414和-2069~-1906处则没有结合。此外,当HP1γ表达沉默以后HP1γ在p21~(Waf1/Cip1)基因启动子上的结合显著减弱(P0.01)。因此,HP1γ可以结合在p21~(Waf1/Cip1)基因启动子上来调节其表达,为典型的负调控方式。由于H3K9me2/3(组蛋白H3第9位赖氨酸2/3甲基化)是HP1家族在染色质上最主要的结合位点,我们想确定HP1γ是否会影响p21~(Waf1/Cip1)基因启动子上组蛋白标记H3K9me2/3水平。我们利用ChIP实验检测了p21~(Waf1/Cip1)基因启动子上H3K9me2/3修饰情况。结果表明,p21~(Waf1/Cip1)基因启动子上存在H3K9me2/3修饰;并且当HP1γ表达沉默以后,p21~(Waf1/Cip1)基因启动子处的H3K9me2/3水平均会显著降低(P0.01),其中H3K9me3水平降低更为显著。这个结果表明HP1γ调控p21~(Waf1/Cip1)基因表达涉及到组蛋白甲基化修饰。微小RNA(miRNA)在细胞生命活动中具有广泛的调节功能,自从被发现以来已经成为生命科学的研究热点。我们通过TargetScan,PicTar和mi Randa在线miRNA-靶基因预测网站筛选出miR-30a(Hsa-miR-30a-5p)可能会靶向结合HP1γ基因。利用荧光素酶报告基因系统我们证明了miR-30a可直接结合在HP1γmRNA的3’-UTR上并抑制荧光素酶的表达。在结直肠癌细胞HCT116和SW620中miR-30a过表达显著抑制了HP1γ蛋白水平的表达,但对HP1γmRNA水平无显著影响。并且在38例新鲜结直肠癌组织标本中mi R-30a和HP1γ蛋白表达水平呈显著负相关(R=-0.5981,P0.01),提示着miR-30a在结直肠癌中可以抑制HP1γ蛋白表达。随后我们在体外、体内对miR-30a在结直肠癌中的生物学功能展开了研究,结果表明miR-30a可以通过下调HP1γ的表达来抑制结直肠癌细胞增殖。除此之外,miR-30a还可以抑制HCT116细胞克隆形成、阻滞细胞周期过程及促进细胞凋亡,在结直肠癌细胞中扮演着抑癌基因的角色。本研究将结直肠癌组织中HP1γ蛋白水平的上调与miR-30a下调联系起来,通过调控p21~(Waf1/Cip1)基因转录来促进结直肠癌细胞增殖。miR-30a/HP1γ/p21~(Waf1/Cip1)级联机制为结直肠癌发病分子机制提供了新的解释,丰富了结直肠癌发病的分子机制,对揭示其发病的精细分子机制、开发有效的治疗措施及判断预后,进一步提高我国结直肠癌的治疗水平具有重要的临床价值和社会效益。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.3

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本文编号：1659186