土木香内酯对非小细胞肺癌增殖的影响及其作用机制研究

发布时间：2018-03-25 06:05

本文选题：土木香内酯　切入点：肿瘤治疗　出处：《吉林大学》2016年博士论文

【摘要】：肺癌是目前世界范围内最常见的恶性肿瘤,也是导致癌症患者死亡的主要病因。根据组织学特点,肺癌可分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌,前者约占肺癌总数的85%。非小细胞肺癌又包括:腺癌、鳞癌和大细胞癌,其中腺癌和鳞癌为主要类型,其发病率分别为50%和30%。目前针对非小细胞肺癌的治疗有很多方法,对于早期非小细胞肺癌患者,手术仍然是首选。但是由于绝大多数肺癌患者首次就诊时就已经诊断为晚期,术后又有较高的复发率,因此术后辅助化疗是预防其复发转移的一种有效手段。目前被广泛认可的治疗方案是以铂类为主的双药联合化疗。近年来,随着分子生物的发展,大量研究发现非小细胞肺癌细胞中存在基因突变,这使得对于进展期非小细胞肺癌的治疗不仅仅局限于化疗,还可以根据已经测定的突变基因,进行靶向治疗。近年来,中草药在肿瘤治疗方面的作用引起了全世界的关注。它以价钱低廉,储备丰富,毒性低等优点被广泛用于癌症治疗,但是由于缺乏强有力的实验室证据,并没有引起全世界的重视。随着实验室技术和方法的进步,传统中药在全球癌症治疗领域发挥着越来越大的作用。关于中草药在肺癌治疗领域的研究也取得了很大的成果。土木香内酯是常见的倍半萜内酯类化合物,主要来源于云木香,旋覆花,土木香根等植物,经研究证实土木香内酯具有抗真菌,抗结核杆菌,抗炎,抗微生物,驱虫等多种生物活性。其分子结构中的α-亚甲基-γ-内酯可能是其发挥作用的必需功能基。近年来发现土木香内酯对结肠癌,黑色素瘤,卵巢癌,前列腺癌和白血病细胞都具有抑制作用,但是土木香内酯对非小细胞肺癌的影响尚不明确。本研究拟通过观察土木香内酯对非小细胞肺癌的影响,并探讨其机制,为非小细胞肺癌的临床治疗提供新的途径,也为土木香内酯临床应用提供理论依据。我们选取肺鳞癌SK-MES-1细胞和肺腺癌A549细胞作为研究对象,通过MTT实验,得到土木香内酯能够抑制非小细胞肺癌细胞的生长,说明其具有抗肿瘤作用。根据以往的研究,凋亡在抗肿瘤药物作用机制中发挥重要作用。因此为了探讨土木香内酯抑制非小细胞肺癌增殖的原因,本研究对土木香内酯作用下的非小细胞肺癌细胞进行凋亡检测,检测结果发现土木香内酯能够诱导肿瘤细胞发生凋亡,并随着浓度的增加,凋亡细胞明显增加。我们同时对SK-MES-1细胞进行周期分布的检测,检测结果显示,土木香内酯能够改变细胞的周期分布,使分布在G1/G0期的细胞增多,提示土木香内酯能够使SK-MES-1细胞阻滞在G1/G0期。凋亡的作用机制复杂,由多重信号通路和蛋白参与。为了进一步探讨土木香内酯诱导凋亡的机制,我们对凋亡相关的信号通路和蛋白进行检测。caspases家族蛋白是凋亡的重要调控者,无论是外源性凋亡途径,还是内源性凋亡途径,都有caspases的参与。根据目前的研究结果我们得出,caspase-8是启动死亡受体途径的关键caspase。线粒体凋亡主要是激活caspase-9。我们的实验结果显示在土木香内酯的作用下,caspase-8,caspase-9均被裂解,其下游的靶分子caspase-3和PARP也同样观察到裂解产物。说明土木香内酯诱导的凋亡途径是双重的,可能通过使细胞内死亡受体配体表达增加和改变线粒体功能促进凋亡发生。线粒体是细胞内重要的细胞器,是细胞内能量代谢的重要场所,也是诱导凋亡发生的蛋白质作用的主要部位。线粒体膜电位(MMP)是体现线粒体功能的指标。MMP异常是导致凋亡的重要原因。因此我们通过流式细胞仪检测细胞内MMP的水平,结果发现在两种细胞中,MMP水平都下降,和对照组相比有明显的差异,说明在这两种细胞中都存在着线粒体功能的障碍,这可能是导致凋亡的重要原因。MMP的变化主要是由于线粒体膜通透性改变,当线粒体通透性转化孔(permeability transition pore,PTP)开放时,线粒体膜去极化,使MMP降低,而这一过程主要受Bcl-2家族蛋白调控。Bcl-2家族蛋白可以分为促凋亡蛋白,以Bax为代表;和抑凋亡蛋白,以Bcl-2为代表。当内源性的刺激信号传来时,分布于细胞浆中的Bax形成二聚体插到线粒体外膜上,破坏线粒体外膜的完整性,从而降低MMP,诱发凋亡。分布于线粒体外膜上的Bcl-2对凋亡起抑制作用。它能够通过自身特定的化学结构结合促凋亡蛋白特定的促凋亡结构域,从而抑制促凋亡蛋白活性,保护线粒体膜的稳定性,达到抑制凋亡的作用。也有研究表明Bcl-2能够与凋亡酶激活因子-1(apoptosis protease-activating factor 1,Apaf-1)结合,阻滞凋亡小体(apoptosome)的形成,而凋亡小体使凋亡得以进行的关键。本研究结果显示土木香内酯作用于NSCLC后,细胞内的的Bcl-2表达下降,而Bax表达增加,说明Bcl-2家族参与了土木香内酯引起的MMP降低。ROS是细胞内级联反应的重要调控者。细胞内过多的ROS能够诱发氧化应激,影响Bcl-2蛋白家族表达进而通过内源性途径导致凋亡发生。ROS还参与细胞内脂质过氧化反应和蛋白质巯基交联反应。这些反应都能够使线粒体膜通透性转化孔开放。有研究也表明土木香内酯能够通过使细胞内ROS水平升高诱导凋亡。为了进一步探讨土木香内酯的作用机制,本研究对NSCLC细胞内的ROS进行检测结果发现土木香内酯能够升高细胞内的ROS水平,提示ROS可能是其介导凋亡的始动因素。ROS增多的原因有待进一步研究。ROS对细胞周期也有一定的调控作用。它能够影响周期进程的多个方面,例如:周期过程中的信号传导通路,介导周期相关蛋白降解的泛素化反应以及构成细胞支架的肌动蛋白活性等。有研究结果显示ROS能够介导细胞发生G1期阻滞,能够使G1期相关周期调控蛋白cyclin D表达减少,使抑制周期进程的p21表达增加,这和我们的研究结果相同,提示土木香内酯介导的SK-MES-1细胞G1/G0期阻滞可能跟细胞内ROS水平升高有关。通过本研究我们可以发现土木香内酯能够通过诱导凋亡和周期阻滞抑制SK-MES-1细胞增殖,在凋亡过程中,内源性和外源性途径都被激活,ROS增加,Bcl-2家族蛋白表达发生改变,引起MMP降低,是内源性凋亡途径激活的原因,同时ROS增加,引起相应的周期相关蛋白表达发生改变,可能是造成周期阻滞的原因。在A549细胞中,土木香内酯的增殖抑制作用主要是通过改变Bcl-2家族蛋白的表达,引起MMP降低,诱发凋亡发生来完成的。综上所述,土木香内酯能够抑制NSCLC的增殖,是一个潜在的可研发的抗肿瘤药物,本研究为其临床应用提供一定的理论基础。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2

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