CD147上调表达与结肠癌耐药及肿瘤侵袭转移的关系及机制研究

发布时间：2018-03-25 16:18

本文选题：CD147　切入点：结肠癌　出处：《山东大学》2015年博士论文

【摘要】：研究背景和意义在全世界范围内,结肠直肠癌(Colorectal cancer, CRC)是在男性的第三常见的癌症(746000例,占总数的10.0%),在女性中排第三位(614000例,占总数的9.2%)。每年有将近70万人死于结直肠癌,高死亡率的主要原因是结直肠癌对化疗药物的耐药和肿瘤的侵袭转移。据报道,大约50%的结直肠癌患者最终将发展至远处转移。随着诊疗规范的逐步推广,临床上对结直肠癌的治疗逐步向多种手段、多层次的方向发展。化疗是一个重要的治疗手段,然而,肿瘤耐药性的产生导致了治疗的失败和肿瘤的转移和进展。所以更好地了解结直肠癌的耐药和转移的分子机制是未来临床上治疗的研究方向所在。CD147也被称细胞外金属基质蛋白酶诱导因子(Extracellular matrix metalloproteinase,EMMPRIN), basigin,M6和肿瘤细胞衍生的胶原酶刺激因子(Tumor cell derived collagenase stimulating factor,TCSF),是一种免疫球蛋白超家族的糖基化细胞表面的跨膜蛋白(Immunoglobulins superfamily,IgSF)结构。CD147蛋白分子由269个氨基酸组成,以两种形式存在：糖基化形式(HG,～ 40-60 kDa)和核心糖基化的形式(LG,～32 kDa),不同类型的组织细胞中二者的比例变化是很大的,而HG-CD147般被认为是功能性的存在形式。CD147在全身许多系统的脏器中均存在表达,包括淋巴循环系统、神经系统、生殖系统、消化系统、运动系统等脏器的组织均检测出CD147的表达,表明其广泛的参与了各种生命活动。已有的研究表明其参与了生殖系统的发育、自身免疫系统疾病的发生进展、微生物的侵袭、肿瘤的侵袭转移等诸多生理和病理过程,是一种在生命活动中具有多种功能的分子。CD147异常表达已经被观察到与多种疾病相关联,尤其是在肿瘤中的异常表达。研究表明,CD147的上调表达出现在包括泌尿系肿瘤、消化道肿瘤、呼吸道肿瘤及皮肤来源的肿瘤等多种肿瘤组织中,且有报道表明部分肿瘤的转移进展与CD147的表达上调存在相关性,研究结果提示CD147介导了肿瘤供养血管的生成,促进了肿瘤细胞增殖,转移,并诱导了耐药性形成。并提示CD147的表达水平可以在一定程度上作为判断患者预后及肿瘤复发的依据。CD147已被证明与透明质酸及ABC家族的多药转运体和单羧酸转运体作用来调控肿瘤的耐药性。此外,CD147能够诱导所述的几种基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)包括MT1-MMP, MMP-1, MMP-2和MMP-9的表达。MMP是降解细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)和基底膜的主要蛋白酶,这对于肿瘤的发生、进展和侵袭是至关重要的过程。已有报道表明,CD147在结肠癌中的表达是上调的。然而,CD147的异常表达是否与结肠癌耐药和及结肠癌的侵袭转移相关目前仍不清楚。在本研究中,我们将通过多层次的实验来评估CD147上调表达对结肠癌细胞的耐药性和肿瘤侵袭转移的影响。我们评估CD147在结肠癌组织及结肠癌细胞株中的表达情况,并分析了其与结肠癌患者临床病理因素的关系。接下来研究了CD147对诱发肿瘤耐药性、肿瘤细胞转移侵袭的影响,并进一步探索了细胞上皮间质转化EMT过程在CD147诱导的结肠癌侵袭转移中的影响,并研究了MAPK/ERK信号通路在参与CD147诱导的结肠癌细胞侵袭转移过程的机制,对CD147影响肿瘤侵袭转移进行了途径机制的研究探讨。这对于攻克结肠癌耐药提供了新的研究靶点,并对进一步寻找抑制结肠癌肿瘤侵袭转移的机制提供了分子生物学依据。第一部分CD147在结肠癌组织及结肠癌细胞中的表达情况目的研究结肠癌组织及结肠癌细胞株中的CD147表达情况。方法收集2013年到2014年间在山东大学附属省立医院胃肠外科由同一手术团队确诊并行根治性手术的结肠癌患者40例。根据患者性别、年龄、肿瘤分化、淋巴结转移情况、局部浸润情况、远处转移情况分别进行分组计数,选取结肠癌组织细胞及对应的切缘肿瘤检测阴性的正常结肠组织细胞,分别采用实时定量PCR(quantificational real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)及蛋白印迹法(Western blot)分别对两组细胞中CD147表达情况进行检测。同时选取购自于中国科学院生物细胞库的结肠癌细胞株Caco-2, SW480, HCT116, HCT15,分别采用实时定量PCR(qRT-PCR)及蛋白印迹法(Western blot)分别对四组细胞中CD147表达情况进行检测,明确CD147在上述组织及细胞中的表达情况,并用统计学方法分析其差异性。同时根据CD147在结肠癌组织的表达高低对40例病例进行了分组,并与患者的临床病理因素分别进行统计学分析,以探讨CD147表达在结肠癌组织中表达与结肠癌不同的临床病理因素的相关性。结果结果表明,结肠癌组织试验中,mRNA检测中有55%(22/40)的病例是高表达的,而蛋白检测中62.5%(25/40)是呈高表达的。同时结肠癌细胞系SW480,Caco-2, HCT116, HCT15中CD147均呈高表达,其中SW480细胞系具有最高的表达,而Caco-2细胞系呈现出最低的表达。为了进一步验证结肠癌组织中CD147表达情况与结肠癌临床病理因素的关系,我们根据结肠癌组织中CD147表达的高低进行分组,分组依据为表达相差1.5倍。然后与患者临床病理因素进行统计学分析(P0.05),结果表明,性别因素：P=0.804,年龄因素：P=0.8,肿瘤分分化程度：P=0.673,局部浸润情况：P=0.055,淋巴结转移：P=0.033,远处转移：P=0.327。这表明CD147的上调表达与结肠癌浸润转移存在相关性。结论明确了CD147在结肠癌组织及结肠癌细胞株中均存在表达,在4组结肠癌细胞株中,SW480细胞系具有最高的表达,而Caco-2田胞系呈现出最低的表达。结肠癌组织中CD147的上调表达与结肠癌侵袭转移存在相关性。意义明确了CD147在结肠癌组织及结肠癌细胞株中的表达情况,揭示了CD147上调表达与结肠癌侵袭转移存在相关性,同时发现了两组表达情况形成显著对比的结肠癌细胞株,为后续进行进一步的细胞转染实验及体外细胞实验奠定了基础。第二部分CD147的上调表达与结肠癌耐药及肿瘤侵袭转移的关系目的进一步通过细胞实验研究CD147上调表达与结肠癌耐药及肿瘤侵袭转移的关系方法根据第一部分实验的结果,我们发现结肠癌细胞株中表达差异明显的两组细胞株SW480, Caco-2。本部分实验中,我们选取这两组细胞系进行细胞转染实验,在Caco-2中分别转染入CD147高表达质粒,及阴性对照组的空载质粒,分别命名为Caco-OvCD147及Caco-cCD147。在结肠癌细胞株SW480分别转染SiRNA载体质粒和对照空载质粒,转染的细胞株分别命名为SW480-SiCD147和SW480-cCD147。经过筛选培养稳定的克隆细胞株,然后分别进行实时定量PCR及western blot实验,验证新建立的细胞株中的CD147表达情况。然后选用CCK-8实验验证CD147诱导结肠癌细胞对5-FU的耐药,选用Transwell实验验证CD147对结肠癌细胞的侵袭能力的影响,选用细胞划痕实验验证CD147对结肠癌细胞迁移能力的影响。结果通过细胞转染实验建立了两组CD147具有显著差异的细胞株Caco-OvCD147和Caco-cCD147以及SW480-SiCD147和SW480-cCD147,并通过qRT-PCR及Western blot实验证实转染后各组新的细胞株中CD147的表达情况。经过转染后的新的细胞株表明Caco-OvCD147中CD147的表达明显高于Caco-cCD147;而SW480-SiCD147细胞中CD147的表达明显低于SW480-cCD147。CCK-8实验表明CD147过表达的Caco-OvCD147的结肠癌细胞在5-FU刺激下存活明显高于对照组Caco-cCD147,而经过转染小干扰RNA的SW480-SiCD147结肠癌细胞存活明显低于对照组SW480-cCD147。Transwell实验表明,Caco-OvCD147细胞株的侵袭能力明显优于Caco-cCD147,而SW480-SiCD147的侵袭能力弱于SW480-cCD147。细胞划痕实验则表明Caco-OvCD147细胞株的细胞迁移能力明显优于Caco-cCD147,而SW480-SiCD147的迁移能力弱于SW480-cCD147。结论CCK-8实验表明CD147上调表达的的细胞株能诱导肿瘤细胞对5-FU的耐药,而Transwell实验及细胞划痕实验则表明CD147上调表达的细胞株侵袭转移能力明显增强。从而证明了CD147的上调表达与结肠癌侵袭转移有明显相关性。意义证明了CD147能诱导肿瘤的对化疗药物的耐药,为今后进一步研究其诱导耐药机制提供了依据；证明了CD147上调表达与结肠癌侵袭转移存在明显相关性,为下一步进一步探索CD147上调表达促进肿瘤侵袭转移的机制提供了依据。第三部分EMT过程及MAPK/ERK通路参与CD147介导的结肠癌肿瘤侵袭转移的研究目的研究细胞上皮间质过渡过程EMT及MAPK/ERK信号通路在CD147介导的结肠癌侵袭转移过程中作用。方法通过细胞转染实验建立了两组CD147表达水平具有显著差异的细胞株Caco-OvCD147和Caco-cCD147以及SW480-SiCD147和SW480-cCD147,并通过qRT-PCR及Western blot实验证实转染后各组新的细胞株中CD147的表达情况。然后通过实时定量PCR及western blot实验检测转染后的各细胞系中EMT过程中的标志物E-cadherin、vimentin以及金属基质蛋白酶MMP-2, MMP-9的表达；同时用qRT-PCR及Western blot实验检测转染后各组细胞株的pERK及总ERK水平。为了进一步验证MAPK通路参与CD147介导的结肠癌细胞侵袭转移,先用MEK抑制剂U0126干预处理处理了Caco-OvCD147和Caco-cCD147细胞株,然后通过Transwell实验及细胞划痕实验进一步验证处理后的细胞的侵袭迁移能力,并且用Western blot实验检测了经U0126处理后两组细胞系Caco-OvCD147和Caco-cCD147中MMP-2, MMP-9的表达情况。结果结果表明在CD147过表达的Caco-OvCD147细胞株较Caco-cCD147中E-cadherin是表达下调的,vimentin的表达是上调的,金属基质蛋白酶MMP-2,MMP-9的表达是上调的,在SW480-SiCD147细胞株较SW480-cCD147中,E-cadherin是表达上调的,vimentin的表达是下调的,金属基质蛋白酶MMP-2,MMP-9的表达是下降的,CD147的上调表达的细胞株Caco-OvCD147中pERK的表达较Caco-cCD147明显增高,转染SiRNA的细胞株SW480-SiCD147中pERK的表达水平较SW480-cCD147的表达水平明显减少,然而总的ERK水平是不变的。经过U0126干预处理的细胞株Caco-OvCD147中MMP-2, MMP-9表达水平较经U0126干预处理的Caco-cCD147水平减少。Transwell实验表明经过U0126干预处理的细胞株Caco-OvCD147细胞侵袭能力弱于经U0126干预处理的Caco-cCD147细胞；细胞划痕实验表明经过U0126干预处理的细胞株Caco-OvCD147细胞迁移能力弱于经U0126干预处理的Caco-cCD147细胞。结论细胞实验结果表明CD147上调促进了肿瘤细胞间质上皮过渡过程EMT,MAPK/ERK通路参与了CD147介导的结肠癌侵袭转移过程。意义阐述了CD147介导结肠癌侵袭转移可能的分子生物学过程,为今后寻找攻克结肠癌转移提供了新的研究靶点。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.35

【共引文献】