GRIM-19对肝细胞癌增殖及转移抑制作用的体内外研究

发布时间：2018-03-25 23:21

本文选题：肝细胞癌　切入点：维甲酸-干扰素诱导死亡相关基因-19（GRIM-19）　出处：《吉林大学》2015年博士论文

【摘要】：背景及目的：在全球范围内，肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）的发病率和死亡率均位居各种恶性肿瘤的前列。由于HCC起病隐匿、进展快、转移早、术后易复发，因此其早期诊断及临床治疗效果尚不理想。分子靶向药物的临床应用为肝细胞癌患者，尤其是传统治疗失败的患者带来了希望，但是在实际临床应用中，仍存在某些不足如发生耐药。究其原因，可能是由于HCC的发生发展过程比较复杂，常涉及多个基因、多个信号通路的改变。因此，阐明肝细胞癌的发病机制，寻找有效的分子治疗靶标已成为亟待解决的问题。恶性肿瘤的发生多与原癌基因激活、抑癌基因失活以及信号转导通路持续激活有关，其中维甲酸-干扰素诱导死亡相关基因-19（Gene associated with retinoid-interferon induced mortality-19，GRIM-19）是新近发现的一种抑癌基因，在调节细胞周期进程、凋亡、先天免疫及能量代谢等方面发挥着重要作用。研究发现，在多种人类恶性肿瘤如乳腺癌、前列腺癌、胃癌及胶质瘤中，GRIM-19发生突变、不表达或表达降低，并与这些肿瘤的发生发展及预后密切相关，其机制可能是GRIM-19的异常导致了某些信号通路持续激活，进而影响肿瘤细胞的周期、凋亡、转移及代谢。然而，GRIM-19在肝细胞癌发生、发展中的作用研究较为少见。因此我们思考，GRIM-19在肝细胞癌发生、发展中的作用如何？上调GRIM-19的表达是否可通过调节相关的信号通路，影响肝癌细胞的细胞周期、凋亡及转移，进而抑制肝细胞癌的增殖及转移？外源性导入GRIM-19能否有效地靶向治疗肝细胞癌? 为了回答上述问题，，本研究首先观察GRIM-19蛋白在人肝细胞癌组织中的表达水平，并分析其表达水平与肝细胞癌临床病理指标的相关性。进而，以低表达GRIM-19的人肝细胞癌SMMC-7721细胞为研究对象，通过重组慢病毒pLVX-Puro-GRIM-19-Myc质粒感染SMMC-7721细胞，建立稳定表达GRIM-19的SMMC-7721细胞株，并在小鼠体内构建肝细胞癌原位移植瘤模型，以减毒沙门氏菌携带GRIM-19质粒进行靶向治疗，观察GRIM-19在体内、体外对肝细胞癌发生、发展及预后的影响，以及对与肝细胞癌发生、发展密切相关信号通路（PI3K/Akt信号通路和JAK/Stat信号通路）的影响。通过以上研究，揭示GRIM-19作为肝细胞癌治疗潜在靶点的可行性，为肝细胞癌的分子靶向治疗提供新的思路。方法：（1）收集吉林大学白求恩第一医院手术切除的54例肝细胞癌及癌旁组织，懫用免疫组织化学染色（IHC）的方法，检测GRIM-19蛋白在癌组织和癌旁组织中的表达；采用NIH Image J形态学图像分析软件，对GRIM-19表达的阳性细胞数及平均光密度进行统计分析，比较GRIM-19蛋白表达水平与肝细胞癌临床病理指标的相关性。（2）体外实验部分：①采用慢病毒包装GRIM-19质粒，获得重组慢病毒pLVX-Puro-GRIM-19-Myc质粒，将其感染SMMC-7721细胞，通过氨苄抗性筛选获得稳定表达GRIM-19的肝癌细胞株；②采用RT-PCR和Western blot（WB）方法检测稳定表达GRIM-19的SMMC-7721细胞中，GRIM-19的mRNA转录及蛋白表达水平；③采用MTT、PI单染流式细胞术、JC-1染色以及Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术分别检测过表达GRIM-19对SMMC-7721细胞增殖、细胞周期、线粒体膜电位以及凋亡的影响；④采用WB及免疫荧光细胞化学染色（IFC）方法检测过表达GRIM-19后，细胞周期相关蛋白（CDK4、PCNA、CyclinD1）、细胞凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2、Cytochrome C、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9）、细胞转移相关蛋白（VEGF、MMP2、MMP9）以及与肝细胞癌发生、发展密切相关信号通路（PI3K/Akt信号通路和JAK/Stat信号通路）中关键蛋白（Akt1、p-Akt1、Stat3、p-Stat3）的表达。（3）体内实验部分：①构建C57BL/6近交系小鼠肝细胞癌原位移植瘤模型，以减毒沙门氏菌（phoP/phoQ突变株）携带GRIM-19质粒，以灌胃方式给予肝细胞癌原位移植瘤模型鼠；②应用小动物超声影像系统检测原位移植瘤体积的变化；③应用PI单染流式细胞术、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术以及TUNEL染色的方法，分别检测原位移植瘤细胞周期及凋亡的变化；④应用WB及IHC方法，检测原位移植瘤中GRIM-19蛋白、细胞周期相关蛋白（CDK4、PCNA、Cyclin D1）、细胞凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、Cytochrome C、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9）、细胞转移相关蛋白（VEGF、MMP2、MMP9）以及与肝细胞癌发生、发展密切相关信号通路（PI3K/Akt信号通路、JAK/Stat信号通路）中关键蛋白（Akt1、p-Akt1、Stat3、p-Stat3）的表达。结果：（1）与癌旁组织相比，GRIM-19蛋白在肝细胞癌组织中表达水平显著降低，甚至缺失，在癌组织中GRIM-19蛋白平均光密度值（OD）为66.686±10.003，而癌旁组织中GRIM-19蛋白OD值为110.720±9.314，差异具有统计学意义（P0.05）。同时GRIM-19在癌组织中表达的阳性率为55.6%（30/54）且均为弱阳性，而在癌旁组织中表达的阳性率为100%(54/54)且以中等强度阳性和强阳性为主。（2）GRIM-19蛋白在人肝细胞癌组织中表达水平与患者年龄、性别、血清AFP水平、肿瘤直径大小等临床病理指标无相关性；而与肝细胞癌组织的转移呈负相关（P=0.022），与病理分级呈负相关（P=0.015），与AJCC TNM分期呈负相关（P=0.024）。（3）体外实验部分，成功构建了稳定表达GRIM-19的SMMC-7721细胞株。与对照组（SMMC-7721组）及空载质粒组（EV组）相比，转染GRIM-19组（GRIM-19组）肝癌细胞中GRIM-19的mRNA转录及蛋白表达水平显著增加；GRIM-19组肝癌细胞增殖能力减弱，细胞周期阻滞于G0-G1期，CDK4、PCNA及CyclinD1蛋白表达下调；GRIM-19组细胞线粒体膜电位减弱，细胞凋亡比例增加，Bcl-2蛋白表达下调，Bax、Cytochrome C、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白表达上调；GRIM-19组肝癌细胞中VEGF、MMP2及MMP9蛋白表达下调；同时，GRIM-19组肝癌细胞中Akt1、p-Akt1、Stat3及p-Stat3蛋白表达明显下调。（4）体内实验部分，成功建立肝细胞癌原位移植瘤模型。给予重组减毒沙门氏菌GRIM-19质粒治疗后，与PBS组（Mock组）以及减毒沙门氏菌空载质粒组（PQ-Scamble组）相比，肝细胞癌原位移植瘤组织中，减毒沙门氏菌GRIM-19组（PQ-GRIM-19组）GRIM-19蛋白表达增高；移植瘤生长减慢，细胞凋亡增加，细胞周期阻滞于G0-G1期，腹腔转移率及平均腹水量明显降低，荷瘤小鼠生存率显著提高，差异具有统计学意义；且细胞周期相关蛋白、细胞凋亡相关蛋白、细胞转移相关蛋白以及相关信号传导通路关键蛋白变化与体外细胞实验一致。结论：（1） GRIM-19蛋白在人肝细胞癌组织中表达下调，与肝细胞癌组织的转移、病理分级及AJCC TNM分期呈负相关，提示GRIM-19缺失可能参与肝细胞癌的发生、发展等过程。（2）利用过表达GRIM-19的体内外肝细胞癌模型，发现GRIM-19表达上调可使肝细胞癌的细胞周期阻滞、凋亡增加、以及转移能力下降。提示GRIM-19表达上调可对肝细胞癌发挥抑瘤作用。（3） GRIM-19可能通过负性调控PI3K/Akt信号通路及JAK/Stat信号通路，进而调控细胞周期相关蛋白、细胞凋亡相关蛋白及细胞转移相关蛋白的表达，从而影响肝细胞癌的增殖及转移，但其具体机制仍有待于进一步研究。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2

【参考文献】