miR-615-5p在胰腺癌中的作用及调节机制研究

发布时间：2018-03-28 09:00

本文选题：胰腺癌　切入点：miR-615-5p　出处：《南京医科大学》2016年博士论文

【摘要】：背景：胰腺癌的病死率高,手术是胰腺癌治疗的最佳选择,但诊断明确时,可切除病例只有80%,大部分已经诊断为晚期、无手术机会,而且五年生存率低于5%。因此,迫切需要讨论其分子发病机制。基因的变异、非正常的转录翻译、甲基化异常等均可导致miRNA在肿瘤中异常表达,大部分miRNA可以做为抑癌基因或癌基因起着抑制肿瘤或致癌的作用,或调控细胞周期进程、分化或凋亡,或影响肿瘤细胞增殖。目的：1、探讨胰腺癌中启动子区异常甲基化的miRNA,研究在胰腺癌细胞中异常甲基化的miRNA的表达情况,探索在胰腺癌细胞中,miRNA表达受DNA高甲基化的影响情况,检测25对胰腺癌及癌旁组织中miR-615-5p的表达。2、应用组织芯片miR-615-5p原位杂交探讨miR-615-5p在胰腺癌组织中的表达情况,并研究miRNA的表达与相关临床病理、预后的关系。3、研究miR-615-5p的下游靶基因及相关富集的信号通路分析,探讨miR-615-5p在胰腺癌细胞中的相关功能。方法：1、应用甲基化芯片及免疫共沉淀的方法筛查胰腺癌细胞及正常胰腺组织中具有甲基化峰值的微小RNA,应用定量PCR对比正常胰腺组织和胰腺癌细胞株中miR-615-5p的表达量差异。对于胰腺癌细胞株应用去甲基化药物处理, 定量PCR分析去甲基化处理前后miR-615-5p差异的表达。定量PCR检测25对胰腺癌及癌旁组织中miR-615-5p表达量。2、将102对块蜡块应用组织芯片仪构建组织芯片(1对包括1例胰腺癌组织及对应的1例癌旁组织),应用原位杂交技术检测102对胰腺癌组织及癌旁组织中miR-615-5p的表达；根据组织芯片miR-615-5p原位杂交的结果,阐述miR-615-5p的表达与病例临床病理资料的关系；进一步分析胰腺癌组织中miR-615-5p的表达对预后的影响,应用Kaplan-meier法比较分析miR-615-5p于胰腺癌患者术后生存时间的相关性,应用Cox回归分析患者生存时间的影响因素。3、构建稳定过表达miR-615-5p的胰腺癌细胞株,分别用EdU、MTT、Transwell侵袭实验、划痕实验、流式细胞仪于体外评价过表达miR-615-5p胰腺癌细胞的增殖、活力、侵袭、迁移能力及细胞周期和细胞凋亡情况；分析miR-615-5p过表达胰腺癌细胞株mRNA表达谱芯片测序结果,下调基因与多个miRNA靶基因软件分析系统(TargetScan等)预测的miR-615-5p调控基因综合分析比较,获得交集基因、预测下游靶基因；分析miR-615-5p调控的基因相关网络与信号通路。结果：1、DNA甲基化芯片结合甲基化DNA免疫共沉淀提示：胰腺组织和胰腺癌细胞中共有8个存在甲基化峰值的微小RNA：miRNA-615,miRNA-663b, miRNA-574,miRNA-1826,miRNA-1247, miRNA-675,miRNA-483,miRNA-663; BSP+TA克隆测序进行验证筛选结果是：PANC-1中miRNA-615的甲基化率明显高于正常胰腺组织。通过定量PCR对比正常胰腺组织,miR-615-5p在胰腺癌细胞株表达量降低。去甲基化药物处理的胰腺癌细胞株中,miR-615-5p重新恢复表达。以正常胰腺组织为参照,与癌旁组织比较,miR-615-5p在21对胰腺癌组织中低表达。2、根据我们试验的要求制作2张组织微阵列,微阵列分布整齐,发现3个脱点,所以位点上的组织均有意义,共102对胰腺癌组织及对应癌旁组织,HE染色及原位杂交染色均满意。运用原位杂交技术检测miR-615-5p结果显示：与胰腺癌组织相比,miR-615-5p在胰腺癌旁组织中表达明显增高,有显著差异(P0.05)。miR-615-5p与患者年龄、性别、淋巴结侵犯及神经侵犯情况之间均无明显相关性(P0.05)。miR-615-5p的表达与肿瘤分化程度、肿瘤大小分级、有无血管侵犯之间有明显相关性(P0.05)。miR-615-5p染色强的患者术后生存时间明显增长,将miR-615-5p代入由临床参数构建模型中表明：miR-615-5p是与胰腺癌患者生存时限有相关性的相对独立因素。3、EdU染色发现miR-615-5p使胰腺癌细胞的增殖能力下降,MTT结果提示miR-615-5p抑制SW1990细胞的活力,Transwell实验提示miR-615-5p降低了SW1990细胞的侵袭能力,划痕实验提示miR-615-5p降低了SW1990细胞的迁移能力。miR-615-5p表达谱芯片测序结果显示,与GFP control转染组比较,miR-615-5p稳染的SW1990细胞株中分别有319个基因表达下调。miR-615-5p稳染SW1990细胞株与对照组比较下调基因与]miRNA调控靶点分析系统预测的miR-615-5p调控基因综合比较,获得14个交集基因。生物信息学软件分析指出14个差异表达基因相关信号通路包括P13K信号传导途径、RAP1信号通路、癌症通路、神经活性配体受体相互作用、缝隙连接等；缝隙连接是显著性富集的信号通路。结论：1、与正常胰腺组织对照,miR-615-5p在胰腺癌细胞中的表达降低,基因启动子区异常甲基化可能成为miR-615-5p异常表达的一个重要机制。。2、在组织芯片上应用miR-615-5p原位杂交技术,可以定性同时半定量反映miRNA在组织中的表达。原位杂交检测miR-615-5p的表达在鉴别胰腺癌与正常胰腺组织时有较高的精确性、特异性,对胰腺癌的发生、发展有重要意义。3、miR-615-5p对于胰腺癌细胞的增殖、活力、侵袭及迁移能力有抑制作用。以高通量mRNA表达谱芯片测序为基础,应用生物信息学的方法,建立多元化的胰腺癌筛选的miR-615-5p相关调控的基因网络,分析相关信号通路,为后来的广泛深入的机制研究提供了便利。
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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.9

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