AhR在MEHP与TCDD共暴露致MCF-7细胞迁移的作用机制研究

发布时间：2018-03-30 05:33

  本文选题：邻苯二甲酸-单-2-乙基己酯　切入点：四氯二苯并-对-二VA英　出处：《天津医科大学》2016年博士论文

【摘要】：目的:本研究旨在探讨邻苯二甲酸-单-2-乙基己酯(Mono(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP)暴露、四氯二苯并-对-二VA英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)暴露、MEHP与TCDD共暴露对乳腺癌细胞MCF-7的增殖、迁移和侵袭,以及对芳香烃受体(Aryl hydrocarbon receptor,AhR)信号通路的影响,以阐明MEHP与TCDD共暴露在乳腺癌发展过程中的作用及机制。方法:1.通过MTS检测0.1μM~100μM的MEHP单独暴露,1nM的TCDD单独暴露,以及MEHP与TCDD共暴露6h、12h、24h、48h,对细胞增殖的影响,采用siRNA技术干扰AhR的表达后再次分析MEHP和TCDD暴露6h和48h对细胞增殖的影响。2.采用Transwell检测1~100μM的MEHP单独暴露,1nM的TCDD单独暴露,以及MEHP与TCDD共暴露24h和48h,对MCF-7细胞迁移和细胞侵袭的影响,并在siRNA干扰AhR后再次检测MEHP和TCDD暴露48h对细胞迁移和侵袭。3.采用PCR-Array方法筛选100μM的MEHP单独暴露,100nM的TCDD单独暴露,以及MEHP与TCDD共暴露24h对肿瘤发展相关基因的影响。4.采用qRT-PCR实验,Western blotting实验检测1μM~100μM的MEHP单独暴露、1nM的TCDD单独暴露、MEHP与TCDD共暴露24h对AhR、CYP1A1和CYP1B1基因和蛋白表达的影响;采用P450-Glo?Assays实验检测1μM~100μM的MEHP单独暴露、1nM的TCDD单独暴露、MEHP与TCDD共暴露48h对CYP1A1和CYP1B1活性的影响;采用染色质免疫共沉淀实验探讨100μM的MEHP单独暴露、1nM和100nM的TCDD单独暴露以及MEHP与TCDD共暴露对AhR与二VA英反应原件(Dioxin-responsive element,DRE)结合的影响。结果:1.MEHP暴露6h和48h均可抑制细胞增殖,具体表现为MEHP 10μM、20μM和40μM暴露6h后可显著抑制细胞增殖(所有P0.001),MEHP 1μM、10μM和20μm暴露48h可显著抑制细胞增殖(p值分别为0.036,0.009和0.026),其他浓度暴露不影响细胞增殖;转染sirna-ahr后并不能缓解mehp对细胞增殖的抑制作用,表明mehp抑制增殖作用不依赖ahr;2.tcdd单独暴露不影响细胞增殖(p值分别为0.208,0.875,0.474和0.751)。mehp与tcdd共暴露6h和48h对细胞增殖的影响存在交互作用(p值分别为0.013和0.011),而共暴露12h和24h对细胞增殖无影响。mehp与tcdd共暴露后,细胞增殖能力显著降低,表明mehp与tcdd共暴露可抑制细胞增殖;ahr干扰后并未缓解mehp与tcdd共暴露对细胞增殖的抑制作用,表明共暴露对细胞增殖的影响不依赖ahr;3.mehp暴露可促进细胞迁移和侵袭,表现为mehp1μm、10μm和100μm暴露24h均可显著促进细胞迁移(所有p≤0.001),mehp10μm和100μm暴露48h后细胞迁移能力显著高于对照组(所有p0.001),mehp10μm和100μm暴露48h后细胞侵袭能力显著高于mehp1μm(p值分别为0.028和0.003);转染sirna-ahr后mehp100μm诱导的细胞迁移作用减弱(p=0.010),但是转染sirna-ahr不影响mehp100μm介导的细胞侵袭(p=0.416),表明mehp介导的细胞迁移依赖ahr,而mehp介导的细胞侵袭不依赖ahr;qrt-pcr结果表明,mehp暴露可增加mmp2,mmp9,vimentin的mrna水平,降低e-cadherin水平(p值分别为0.025,0.003,0.003和0.002);sirna干扰ahr后可抑制mehp介导的mmp2基因表达(p=0.044)。4.1nm的tcdd暴露24h和48h均可显著促进细胞迁移(所有p≤0.001);在细胞迁移上,mehp与tcdd之间存在拮抗性交互作用(p=0.001),而在细胞侵袭上无影响(p=0.056);sirna干扰ahr后可显著抑制tcdd暴露诱导的细胞迁移(p=0.001);sirna干扰ahr后,tcdd单独暴露组mmp2、mmp9基因表达水平均显著降低(p值分别为0.032和0.043),表明tcdd介导的mmp2和mmp9表达依赖ahr。5.pcr-array结果表明,mehp暴露可显著上调23个基因表达,下调8个基因表达;tcdd暴露可显著上调22个基因表达,下调6个基因表达。在18个基因表达上,mehp可产生与tcdd相同的作用,包括14个上调的基因和4个下调的基因。在mmp14,pai1,plau,gpx1,pou5f1,cxcr4,jup,dll4和cyp1a1等9个基因上mehp与tcdd之间存在拮抗作用,在il1b,cdh5,nfe2l2,mtor和mapk14上mehp与tcdd共暴露存在协同作用。6.MEHP暴露6h、12h、24h和48h均可显著增加AhR的表达,同时显著增加CYP1A1和CYP1B1的表达,且AhR,CYP1A1,CYP1B1的mRNA水平随MEHP浓度增加而增加(所有P≤0.001),随暴露时间延长而增加(所有P≤0.001)。转染siRNA-AhR后,MEHP诱导的CYP1A1与转染siRNA-NC相比下降39.91%,CYP1B1下降43.28%;染色质免疫共沉淀结果表明,MEHP暴露2h即可增加AhR与CYP1A1和CYP1B1调节区域的DRE结合,Luciferase报告基因结果显示MEHP可显著上调CYP1A1的启动子活性,证明MEHP可通过上调AhR的表达,并增加AhR的转录活性,进而诱导CYP1A1和CYP1B1的表达;7.MEHP与TCDD共暴露对AhR和CYP1A1基因表达存在拮抗性交互作用(P值分别为0.009和0.041),MEHP介导的AhR基因表达被TCDD抑制,同时TCDD介导的CYP1A1基因表达可被MEHP抑制;MEHP与TCDD共暴露对CYP1B1的表达交互作用无统计学意义(P=0.586);转染siRNA-Ah R后,TCDD诱导的CYP1A1显著降低,且MEHP对TCDD介导的CYP1A1表达的拮抗作用消失,表明TCDD与MEHP共暴露在CYP1A1的表达过程中的拮抗作用依赖AhR;染色质免疫共沉淀结果表明,MEHP可拮抗性降低AhR与CYP1A1启动子区域的DRE结合,由此拮抗TCDD介导的CYP1A1的表达。结论:1.MEHP具有AhR活性,可上调AhR的表达和转录活性,是MEHP促进MCF-7细胞迁移的作用机制之一。2.MEHP与TCDD共暴露可拮抗TCDD介导的AhR与DRE的结合,从而拮抗TCDD介导的CYP1A1的表达。3.MEHP与TCDD在MMP14,PAI1,PLAU,GPX1,POU5F1,CXCR4,JUP,DLL4的表达上具有拮抗作用,在IL1B,CDH5,NFE2L2,MTOR和MAPK14等5个基因表达上具有协同作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9

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本文编号：1684590