DNA功能化组装及其在生物分子检测中的应用研究

发布时间：2018-03-30 15:30

本文选题：DAN正四面体　切入点：手性组装　出处：《东南大学》2017年博士论文

【摘要】：早期诊断和早期治疗是改善癌症患者的预后及降低其死亡率的关键所在。肿瘤标志物在其中发挥着重要作用。除了传统的肿瘤标志物,近年来许多新的且有效的生物分子标志物也相继被学者发现,其中包括基因甲基化、多种基因突变、端粒酶、血中循环DNA及microRNA。众多研究表明,以上几种生物分子标志物对癌症早期诊断及预测的敏感性,特异性均不低于传统标志物。因此,上述几种标志物极可能被广泛用于临床上对癌症的早期诊断、判断预后、和评价治疗效果。针对这一研究目的,本论文旨在研究DNA与贵金属纳米粒子,荧光、电化学活性物质等信号分子及生物大分子的组装方法,利用其对信号分子的高负载量以及可以在其不同位点同时精确组装几种不同生物分子的特性,设计合成了多种DNA纳米生物探针,构建生物分子标志物高灵敏、多组分同时检测的新方法。本论文的主要内容如下:1.金纳米粒子手性二聚体用于检测DNA甲基转移酶活性及其抑制剂利用DNA诱导金纳米粒子进行手性组装和限制性内切酶HpaⅡ检测DNA甲基转移酶活性及其抑制剂。首先,研究粒子尺寸和粒子间距对手性金纳米粒子二聚体手性信号的影响,筛选出手性信号最强的金纳米粒子二聚体作为DNA甲基转移酶的检测探针。然后利用限制性内切酶HpaⅡ可以识别并切断二聚体之间的5'-CCGG-3'核酸序列,从而破坏二聚体结构,手性信号减弱。如果有甲基转移酶M.SssI存在时,5'-CCGG-3' DNA序列被甲基化为5'-CCmGG-3',限制性内切酶HpaⅡ无法切断此甲基化序列,因而完整的金纳米粒子二聚体依然保持很强的手性信号。该方法具有宽的线性范围(0.5 U mL-1到150 U mL-1)、低的检测限(0.27 U mL-1)、高的选择性及良好的稳定性。同时,我们也用此方法评估了 5-氮杂胞嘧啶核苷和普鲁卡因对甲基转移酶的抑制效果。总的来说,此方法具有较好的准确度,特异性,灵敏度,可以检测血清样本,有益于临床诊断和药物开发。2.金纳米粒子手性二聚体用于检测8-羟基脱氧鸟苷以8-羟基脱氧鸟苷的核酸适体组装的金纳米粒子手性二聚体为信号探针,检测DNA氧化应激损伤的标志物:8-羟基脱氧鸟苷。首先利用8-羟基脱氧鸟苷的核酸适体组装金纳米粒子二聚体。透射电镜TEM可以观察到金纳米粒子二聚体的生成,CD光谱仪可以检测到此二聚体具有很强的手性信号。当溶液中含有检测物8-羟基脱氧鸟苷时,检测物会与其核酸适体结合,从而破坏二聚体结构,手性信号减弱。通过此方法我们可以定量检测0.05nM到2nM的8-羟基脱氧鸟苷,最低检测线为33 pM (信噪比为3)。同时,此方法可用于评估人血清样本中8-羟基脱氧鸟苷的含量。总的来说,此方法具有较好的准确度,特异性,灵敏度,可以检测血清样本,有益于临床诊断。3. DNA正四面体探针用于端粒酶活性的电化学检测以DNA正四面体纳米材料为基础,研究其在电化学检测肿瘤标志物端粒酶中的应用。在DNA正四面体的一个顶点引出端粒扩增引物,其他三个顶点修饰巯基,通过金硫键将此探针共价修饰到金电极表面。当端粒酶存在时,端粒酶特异性识别端粒引物,并在其3'末端扩增出(TTAGGG)x富G序列。该富G序列在钾离子和氯化血红素的作用下形成G-四链体,是一种具有类似辣根过氧化物酶催化性质的DNA模拟酶。该DNA模拟酶在过氧化氢的存在下催化苯胺聚合成具有电化学活性的聚苯胺。我们利用示差脉冲伏安法检测聚苯胺的电化学信号从而检测端粒酶活性。通过调节DNA正四面体探针的尺寸,可以控制相邻端粒引物的距离。当此距离接近端粒酶的尺寸时,端粒酶识别端粒引物并进行扩增的效率大大增强,从而我们可以得到最佳的电化学输出信号,显著提高检测灵敏度。利用此方法,可以评估MCF-7,A549, MDA-MB-231,HeLa等细胞中的端粒酶活性。该方法的最低检测限为1个细胞/10微升,检测范围为5到5000个细胞,与单链端粒引物探针相比,信号提高20倍。该方法用于检测膀胱癌患者尿样中脱落细胞的端粒酶活性时,得到的结果与临床病理检测结果一致。4.基于荧光共振能量转移效应同时检测三种与肺癌相关microRNA设计三种不同荧光素(Cy3, Cy3.5, Cy5)标记的核酸探针,对应识别三种microRNA(miRNA-155, miRNA-182, miRNA-197),形成双螺旋核酸探针。核酸染料TOTO-1可以嵌入到核酸探针骨架中,通过单波长激发,将荧光共振能量转移给相应的荧光素,产生不同的荧光信号,实现多组分检测肿瘤标志物microRNA。显著提高相关肿瘤诊断的准确度。核酸染料TOTO-1本身在溶液中几乎不发出荧光信号,但当它嵌入到双链核酸骨架中时,其荧光信号显著提高约1000倍。其发射光谱与Cy3, Cy3.5, Cy5的激发光谱重叠,可以产生荧光共振能量转移效应。miRNA-155, miRNA-182, miRNA-197作为肺癌发病早期的标志物,在血浆中同时诊断出三种microRNA的存在,可以显著提高疾病诊断的准确度,为临床上疾病的早期诊断提供有效途径。因此多组分检测肿瘤标志物microRNA在生物医学和临床中具有广阔的应用前景。5.金纳米粒子比色法检测甲型流感病毒H3N2金纳米粒子表面功能化修饰抗血凝素单克隆抗体(mAb),得到mAb-AuNPs探针。mAb-AuNPs探针通过抗血凝素单克隆抗体特异性识别甲型流感病毒囊膜表面富含的血凝素,从而得到探针/病毒组装体。该探针/病毒组装体上的金纳米粒子相邻很近,容易产生等离子共振耦合(SPR)效应,在紫外可见光谱上表现为金纳米粒子的最大吸收峰发生红移,裸眼可见组装体的溶液由红色变为蓝色。同时,利用透射电子显微镜(TEM)技术和动态光散射(DLS)技术对探针/病毒组装体进行表征。在最佳检测条件下,我们利用此方法可以最低检测出7.8 HAU的甲型流感病毒H3N2IAV (A/Brisbane/10/2007)。此方法展现出高特异性、准确性、稳定性。重要的是,此方法利用功能化金纳米粒子可以一步法检测流感病毒,紫外光谱读出信号,不需要进行信号放大。同时,此方法可以扩展应用到其他病原体的可视化检测。
[Abstract]:In addition to the traditional tumor markers , many new and effective biomarkers have been found to be used in the early diagnosis of cancer , to judge the prognosis and to evaluate the therapeutic effect . In general , the method has better accuracy , specificity and sensitivity , and can detect the content of 8 - hydroxydeoxyguanosine in human serum sample . The invention relates to a method for detecting telomerase activity in MCF - 7 , A549 , MDA - MB - 231 , HeLa cells . At the same time , the probe / viral assembly was characterized by means of transmission electron microscopy ( TEM ) and dynamic light scattering ( dls ) . Under optimal detection conditions , we can detect the influenza A virus of 7.8 HAU by using this method . This method exhibits high specificity , accuracy and stability . It is important to use functionalized gold nanoparticles to detect influenza virus and ultraviolet spectrum read signal one step .

【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R730.4;O652

【参考文献】