MicroRNA-124-3p在膀胱癌细胞中的抑癌作用及分子机制研究

发布时间：2018-03-31 03:35

本文选题：膀胱癌　切入点：miR-124-3p　出处：《浙江大学》2016年博士论文

【摘要】：背景膀胱癌是泌尿系统疾病中最常见的恶性疾病之一,也是全身十大常见肿瘤之一。目前,膀胱癌的发病率在我国居于泌尿生殖系肿瘤发病率的第一位,而在欧美国家,膀胱癌的发病率仅次于前列腺癌,位于泌尿系肿瘤发病率的第二位。尽管膀胱癌在临床十分常见,目前对于膀胱癌的发生与发展的机制,特别是分子机制仍缺乏足够深入的理解。多年的研究表明,膀胱癌的发生和进展是一个多因素,多基因参与,分阶段进展演变的疾病。在内源和外源危险因素的作用下,多个基因出现突变或者功能失常,这些致病因素在一定时间内逐渐积累,并最终导致恶性的疾病表型的出现。近年来,内源性非编码RNA的研究越发深入,而MicroRNA是这其中研究较为深入的一类。MicroRNA是一种基因编码转录生成的RNA单链分子,长度约为20-24个核酸。研究表明这些RNA在基因的表达和调控方面有着重要作用。而在各种因素的影响下MicroRNA这种调控基因表达的功能的紊乱或者缺失会导致包括肿瘤的各种疾病的发生。本研究着重于筛选这样的在膀胱癌中异常表达的的MicroRNA并进一步的探索其在膀胱癌细胞中的生物学功能和分子机制。目的采用Real Time Quantitative PCR检测膀胱癌患者手术后的标本中的miR-124-3p的表达状况；在体外实验部分,对比膀胱移行上皮细胞株SV-HUC1,检测膀胱癌细胞株T24, UM-UC-3, J82中的miR-124-3p的表达情况。进一步探索miR-124-3p的靶点和生物学功能,以及miR-124-3p调控这些生物学行为的分子机制。方法1.在13对配对的膀胱癌组织标本检测miR-124-3p的相对表达量,对膀胱癌组织及对照的正常粘膜组织中miR-124-3p的表达差异进行统计；2.体外实验,使用膀胱癌T24, UM-UC-3, J82细胞株,转染miR-124-3p模拟体,外源性地过表达miR-124-3p.通过CCK-8、平板克隆形成、流式细胞周期和划痕愈合实验和Transwell小室法等手段来探索外源性地过表达miR-124-3p对膀胱癌细胞产生的生物学功能上的影响；3.使用多种在线靶点预测软件对miR-124-3p的靶基因进行预测,利用膀胱癌组织芯片检测靶基因在膀胱癌组织中的表达。然后利用Real Time PCR和Western Blot首先确定预测的靶基因是否随着外源性的miR-124-3p过表达而变化,以及使用预测的靶基因的干扰RNA试验是否能得到与过表达miR-124-3p相似的生物学功能。下一步利用荧光素酶双报告系统对miR-124-3p的靶基因及结合位点做进行进一步地鉴定,确定miR-124-3p的直接靶点。最后使用拯救实验进一步验证miR-124-3p及其靶基因在膀胱癌细胞中的功能。4.使用Western Blost对下游的信号传导通路基因进行检测,进一步探索miR-124-3p发挥生物学功能的分子机制。结果1.在所有收集的13例膀胱癌癌组织标本中,miR-124-3p均相对低表达。有11例膀胱癌组织中的miR-124-3p表达量小于癌旁组织的50%。对比膀胱移行上皮细胞株SV-HUC-1,膀胱癌细胞株T24, UM-UC-3, J82中,miR-124-3p均为低表达。2.体外转染终浓度为50nM的miR-124-3p mimic至膀胱癌T24,UM-UC-3,J82细胞株中,可以抑制细胞增殖。体外平板克隆形成实验能明显抑制细胞克隆形成,并有G1期阻滞。划痕愈合实验和Transwell小室实验显示miR-124-3p过表达可以减弱T24, UM-UC-3, J82细胞的迁移和侵袭能力。3.通过多种在线软件的分析,预测ROCK1可能是miR-124-3p的靶基因,同时通过Real Time PCR和Western Blot实验检测到ROCK1在转染miR-124-3p模拟体后在mRNA水平和蛋白水平的表达量都有所下降。ROCK1的siRNA能够产生于miR-124-3p模拟体相似的生物学功能。荧光素酶双报告系统分析证实ROCK1的mRNA是miR-124-3p的直接结合靶点,它的3’-UTR中存在miR-124-3p的结合序列。4.miR-124-3p能够逆转膀胱癌细胞的上皮间质转化,并抑制转移相关基因c-Met, MMP2, MMP9的表达。结论1.对比癌旁组织,膀胱癌组织中miR-124-3p相对表达量较低。但是本研究未能提示miR-124-3p表达量高低与膀胱癌的恶性程度相关。2.体外转染miR-124-3p模拟体使miR-124-3p外源性的过表达,削弱了膀胱癌T24, UM-UC-3, J82细胞株的增殖能力,迁移和侵袭能力。3.miR-124-3p的直接靶基因是ROCK1,并影响下游迁移和侵袭通路的蛋白表达。4. miR-124-3p能够参与调控膀胱癌细胞的上皮间质转化。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.14

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