神经胶质瘤外泌体介导调节性B细胞的作用研究

发布时间：2018-04-02 01:10

本文选题：胶质瘤　切入点：外泌体　出处：《第三军医大学》2016年博士论文

【摘要】：侵袭和转移是恶性肿瘤的重要生物学标志,也是导致肿瘤治疗失败和复发的重要原因之一。高度侵袭性是恶性胶质瘤的重要病理学特征,瘤体边界不清致使手术完整切除难度增大,从而导致肿瘤很快复发,这是患者预后差,复发率、死亡率高的主要原因。脑胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤,国内脑胶质瘤的发生率占颅内肿瘤的35%~60%,5年生存率仅为20%~30%,是神经外科临床工作中面临的最严重的肿瘤之一。对脑胶质瘤的治疗措施,传统上仍然以手术为最重要的手段,但由于胶质瘤多为浸润型生长,单纯的手术治疗后,很容易复发,疗效并不能使人满意。由于肿瘤细胞存在放疗抗拒,术后放疗尚不能杀灭残余的肿瘤细胞,因此研究肿瘤细胞是通过怎样的机制逃避放疗的杀伤和如何降低此种机制的作用,对提高放疗在胶质瘤治疗中的疗效有很大的必要性。肿瘤细胞的免疫逃避是指其通过多种方式逃避机体的免疫识别和攻击,例如:细胞表面标志物的改变,包括肿瘤细胞表面的MHCⅠ类分子表达下降或者缺失、肿瘤抗原的变异、FAS系统的作用、B7分子的表达异常等。肿瘤来源的免疫抑制因子:如IL-10、VEGF、TGF-β等,其可以影响DC细胞及T细胞的成熟活化。肿瘤微环境诱导T细胞功能障碍,其中主要是通过受体/配体结合的方式释放抑制性的信号,降低T细胞的功能。T细胞功能的障碍,会导致机体免疫减弱。PIGF在癌变的情况下会引起高表达,同时它的相关受体VEGFR1的表达也会提高。PIGF在多种肿瘤中明显上升,可以作为某些癌症的指标性物质。PIGF不仅可以刺激血管源细胞形成新血管,而且PIGF可以直接作用于肿瘤细胞,损伤DC细胞,从而促进肿瘤的生长,也可以刺激骨髓中血管生成祖细胞转移向肿瘤病灶。加入PIGF抗体在体内不仅可以阻止新血管的生成,还可以刺激已生成血管的退化。最近研究报道显示PlGF也参与了神经胶质瘤的病理和免疫调节过程。我们假设胶质瘤分泌的PlGF通过外泌体作用于胶质瘤病灶微环境中的B细胞,使B细胞能够表达TGF-β,转化为TGF-β(+)的Bregs细胞,Bregs细胞可以特异性的抑制胶质瘤患者CD8(+)T细胞的增殖和活性,从而胶质瘤细胞逃避免疫监视向正常组织侵袭扩散。通过本研究证明:1从胶质瘤组织中分离纯化的恶性胶质瘤细胞(whoⅢ~Ⅳ级)在体外培养后,细胞内plgfmrna和蛋白有表达,当用不同浓度的pma刺激后plgf随其浓度增加而增加。表明恶性胶质瘤细胞中有plgf表达。2密度梯度离心分离胶质瘤细胞上清中的外泌体,lamp-1特异性验证外泌体后,裂解外泌体后可检测出plgf蛋白,表明胶质瘤细胞可以表达plgf,并且其外泌体中也含有plgf蛋白3正常人全血中分离获得na?veb细胞(cd19+il-7r+cd45+),将收集的胶质瘤外泌体用csfe标记后与na?veb细胞共培养,免疫荧光染色后激光共聚焦显微镜观察发现na?veb细胞可以捕获胶质瘤外泌体;进一步将捕获胶质瘤外泌体的na?veb细胞,用单价plgf和其抑制剂的na?veb细胞为对照,结果显示:不同浓度外泌体刺激的b细胞随外泌体浓度的升高tgf-βmrna和蛋白都增高,单加plgf也可使na?veb细胞表达tgf-β增加。表明携带plgf的胶质瘤外泌体可以被naiveb细胞捕获,捕获后的na?veb细胞可特异表达tgf-β,且与plgf调控有关;即携带plgf的外泌体可以将胶质瘤病灶微环境中na?veb细胞转化为tgf-β(+)bregs细胞。4将胶质瘤组织中分离的b细胞、胶质瘤患者外周血中的b细胞以及刺激转化的tgf-β(+)bregs细胞分别用csfe标记,提取胶质瘤组织内含物,10mg/ml的胶质瘤组织提取物分别刺激三种获得的b细胞,以10mg/mlbsa为阴性对照,5%co237℃孵箱培养3天后流式检测三种b细胞增殖程度,结果表明:91.2%的组织来源b细胞增殖和8.14%的外周血b细胞增殖,约有60.8%的bregs细胞得到增殖,结果显示增殖的b细胞具有胶质瘤特异性,胶质瘤特异性bregs细胞可能存在胶质瘤组织和胶质瘤患者的外周循环系统中5从胶质瘤患者全血中密度梯度离心分离pbmc后,接种75cm细胞培养瓶中培养2h后,将贴壁细胞与非贴壁细胞分开培养,加入不同细胞刺激因子培养7天获得dc细胞和t细胞,再采用磁珠法分离纯化cd8(+)cd25(-)t细胞。将获得的cd8(+)cd25(-)t细胞用csfe标记后,按30万:20万比例与dc细胞混合接种于96孔细胞培养板中,10mg/ml胶质瘤组织提取物,阴性对照加入10mg/mlbsa,然后加入20万诱导bregs细胞、naiveb细胞以及诱导bregs细胞先与胶质瘤提取物培养后刺激3天,不加b细胞为对照。结果显示:,流式细胞结果以csfe标记细胞设门,bsa刺激的cd8+t细胞增殖2.18%,胶质瘤提取物刺激的cd8+t细胞增殖23.0%,提示其中有一部分为胶质瘤特异性cd8+t细胞扩增;胶质瘤特异性CD8+T细胞可被胶质瘤特异性诱导Bregs细胞抑制活性,CD8+T细胞增殖为2.11%,天然B细胞则不能抑制CD8+T细胞增殖为30.2%。诱导Bregs细胞与T/DC细胞相同条件分开培养后再混合也可以抑制,CD8+T细胞增殖3.33%。胶质瘤提取物培养刺激胶质瘤患者CD8+T细胞可以分泌颗粒酶B和穿孔素,当Bregs细胞存在时也可以抑制其分泌。表明携带PlGF外泌体诱导的TGF-β(+)Bregs细胞具有特异性抑制胶质瘤CD8(+)T细胞增殖,同时穿孔素与颗粒酶B检测结果显示Bregs细胞也可抑制CD8(+)T细胞的杀伤活性。总之,在恶性胶质瘤细胞中异常表达的Pl GF,通过细胞外泌体携带PlGF被胶质瘤病灶周围的Naive B细胞捕获,使肿瘤微环境的Naive B细胞转变为TGF-β(+)Bregs细胞,该Bregs细胞具有胶质瘤特异性,可以抑制特异性胶质瘤CD8(+)T增殖和活性,可能是胶质瘤细胞逃避免疫监视侵袭正常组织的机制之一。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41

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