NRAGE基因稳定转染食管癌细胞系的建立及其放射抗性机制研究

发布时间：2018-04-02 10:46

本文选题：NRAGE　切入点：食管癌　出处：《河北医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：目的:食管癌是全球威胁人类生命和健康的最常见恶性肿瘤之一,我国每年食管癌发病人数占全球发病总人数的一半以上,以食管鳞癌最为常见。放射治疗是食管癌三大治疗手段之一,而放射抵抗性是导致其治疗失败的主要原因。我们前期研究发现NRAGE在放射抗性细胞株TE13R120中表达量明显高于亲本TE13细胞,且NRAGE亚细胞定位变化可能参与了食管癌细胞放射抗性的形成。本研究旨在通过基因转染构建NRAGE稳定表达的食管癌细胞系,采用Real-Time PCR和Western Blot验证转染效果,并通过细胞克隆形成实验、流式细胞术等观察该基因影响放射抗性的具体机制,进一步明确NRAGE基因与食管鳞癌细胞放射抗性的关系,为将来NRAGE基因在食管癌放射治疗中的研究提供细胞模型及实验依据。方法:1采用Real-Time PCR及Western Blot检测3种食管癌细胞系(TE13、Eca109、Kyse170)中NRAGE的m RNA及蛋白表达情况,选择NRAGE低表达细胞进行稳定转染。2以脂质体为载体,将携有NRAGE基因的真核表达质粒p3XFLAG-CMV-14-NRAGE转染NRAGE低表达的细胞,实验分二组,NRAGE基因转染组(Eca109/NRAGE组)和空白对照组(Eca109组)。采用G418筛选获得稳定转染的细胞系(Eca109/NRAGE)。3采用Real-Time PCR及Western Blot验证转染组和空白对照组细胞中NRAGE基因的表达。4采用平板克隆形成实验比较转染组和空白对照组细胞的放射抗性,探讨该基因对食管鳞癌细胞放射抗性的影响。5应用流式细胞术检测转染组和空白对照组细胞的细胞周期变化。6通过流式细胞术检测转染组和空白对照组细胞的凋亡情况。7应用Real-Time PCR及Western Blot验证两组细胞中β-catenin基因的表达。结果:1 Real-Time PCR及Western Blot结果显示NRAGE的m RNA及蛋白表达水平在Eca109细胞中最低,因此选择Eca109细胞进行以下试验。2 Real-Time PCR及Western Blot结果证实转染组NRAGE的m RNA及蛋白表达均高于空白对照组(P=0.000),证明外源性NRAGE基因已整合于细胞基因组中,并获得稳定表达。3平板克隆形成实验证明Eca109与Eca109/NRAGE组细胞的放射敏感性不同,(D0值分别为1.54和1.76Gy,Dq值分别为1.29和1.41Gy,SF2值分别为0.44和0.51,N值分别为1.838和1.802)。转染组细胞的D0、Dq值均增大,且SF2值是是空白对照组细胞的1.159倍,细胞存活曲线肩区增宽,这均提示NRAGE转染组细胞比空白对照组更具有放射抗性。4流式细胞技术分析显示,与对照组细胞相比,转染组细胞中对射线抵抗性最强的S期细胞比例增加,而对射线最敏感的G2/M期减少。5细胞凋亡检测表明,Eca109/NRAGE组细胞凋亡率较Eca109组细胞降低(P=0.0029)。6 Real-Time PCR及Western Blot结果显示β-catenin的m RNA及蛋白表达在Eca109/NRAGE组细胞中的表达量明显高于Eca109组细胞(P=0.000)。结论:1通过脂质体介导,可以建立NRAGE基因稳定表达的食管癌细胞系。2 NRAGE参与了Eca109/NRAGE组细胞放射抗性的形成。3 NRAGE改变了Eca109/NRAGE组细胞的细胞周期分布和凋亡,并可能影响食管癌细胞放射敏感性。4 NRAGE可能通过激活Wnt/β-catenin信号转导通路参与放射抗性的形成。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.1

【参考文献】