维甲酸-miR-16-CDC25B通路对多发性骨髓瘤发病机制的研究

发布时间：2018-04-03 13:09

  本文选题：CDC25B基因　切入点：miRNA-16　出处：《福建医科大学》2015年硕士论文

【摘要】：目的:检测CDC25B在多发性骨髓瘤中的表达;构建sh RNA-CDC25B慢病毒表达载体,沉默骨髓瘤细胞株CDC25B基因的表达,探究CDC25B基因沉默后对骨髓瘤细胞生物学特性的影响;利用生物信息学反向预测调控CDC25B的mi RNA,构建该mi RNA高表达的慢病毒载体以靶向抑制CDC25B基因的表达,由此通过稳定干扰CDC25B基因的骨髓瘤细胞株观察mi RNA抑制CDC25B基因后对骨髓瘤细胞的生物学效应;研究全反式维甲酸对多发性骨髓瘤细胞的生物学效应及其作用其机制。方法:(1)利用基因芯片和Western Blot检测CDC25B在多发性骨髓瘤患者中的表达。(2)利用real-time PCR和western blot检测CDC25B在骨髓瘤细胞株RPMI8226和U266中的表达。设计合成以CDC25B为靶标的sh RNA,构建慢病毒表达载体—GV248-sh RNA,并以空载体做对照。由上海吉凯公司包装出高滴度的慢病毒颗粒,感染CDC25B表达明显上调的骨髓瘤细胞株,经流式细胞仪分选获得稳定株;利用CCK8检测sh RNA干扰CDC25B后骨髓瘤细胞增殖、流式细胞术(FCM)检测干扰后骨髓瘤细胞周期和凋亡的变化、Hoechst 33258荧光染色法观察干扰后细胞凋亡的形态变化。(3)利用荧光素酶报告系统检测mi R-16对CDC25B表达的影响。(4)利用real-time PCR检测mi R-16在骨髓瘤细胞株RPMI8226和U266中的表达;设计合成mi R-16序列,构建慢病毒表达载体—GV217-mi R-16,以空载体做对照,由上海吉凯公司包装出高滴度慢病毒颗粒,感染mi R-16表达明显下调的骨髓瘤细胞株,再经流式细胞仪分选获得稳定细胞株;real-time PCR检测mi R-16及CDC25B m RNA表达,Western blot检测CDC25B蛋白表达,CCK8检测过表达mi R-16的骨髓瘤细胞增殖,FCM检测过表达mi R-16骨髓瘤细胞周期和凋亡的变化。(5)不同浓度全反式维甲酸(ATRA)作用于骨髓瘤细胞后,应用CCK8检测细胞增殖变化,采用48小时50%抑制率的药物浓度(IC50)作用于骨髓瘤细胞,FCM检测48小时后骨髓瘤细胞周期和凋亡的变化,real-time PCR、western blot检测ATRA作用后骨髓瘤细胞mi R16和CDC25B表达情况。结果:(1)收集临床确诊的初治多发性骨髓瘤患者和正常供者的骨髓标本,基因芯片和Western blot检测显示,多发性骨髓瘤患者CDC25B明显高表达。(2)real-time PCR和western blot结果显示,CDC25B m RNA和蛋白水平表达在骨髓瘤细胞RPMI8226中明显高于U266;real-time PCR结果显示mi R-16在骨髓瘤细胞RPMI8226中表达明显低于U266。由此,我们选用RPMI8226作为细胞模型进行后续实验。(3)成功构建、包装高表达GA248-sh RNA-CDC25B的慢病毒,感染骨髓瘤细胞RPMI8226并建立稳定细胞株;real-time PCR和Western blot结果显示干扰组细胞CDC25B m RNA和蛋白水平表达均明显下调,sh RNACDC25B干扰成功。(4)CDC25B基因沉默后对骨髓瘤细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响:①CCK8结果显示:与空载对照组相比,基因沉默后RPMI8226细胞增殖受抑,24~96小时抑制率为25.41~28.22%;②FCM检测细胞周期显示:RPMI8226对照组和干扰组G2/M期细胞比例分别为9.21±0.09%和32.60±2.93%(P0.05);③FCM检测细胞凋亡显示:RPMI8226对照组和干扰组细胞凋亡率分别为:17.28%和35.31%。(5)荧光素酶报告系统检测高表达mi R-16对CDC25B的影响:mi R-16靶向CDC25B 3’UTR。(6)成功构建并包装高表达mi R-16慢病毒,感染骨髓瘤细胞RPMI8226并建立稳定细胞株。real-time PCR结果显示:高表达mi R-16组细胞mi R-16表达上调约1448.15倍,过表达mi R-16成功;real-time PCR和western blot结果显示:CDC25B在m RNA和蛋白水平表达均下调,mi R-16靶向抑制CDC25B成功。(7)mi R-16靶向抑制CDC25B后对骨髓瘤细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响:①CCK8显示:与对照组相比,RPMI8226干扰组细胞增殖受抑,24~72小时增殖抑制率为18.78~30.74%;②FCM检测细胞周期结果显示:RPMI8226对照组和干扰组G2/M期细胞比例分别为15.00±3.14%和29.90±3.60%(P0.05);③FCM检测细胞凋亡结果显示:RPMI8226细胞对照组和干扰组凋亡率分别为:17.10%和32.84%。(8)ATRA对RPMI8226细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响:①不同浓度(0.1μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)ATRA作用于RPMI8226后24~96小时,骨髓瘤细胞增殖抑制率分别为7.17~37.95%、8.42~54.09%、14.38~66.65%、17.01~74.46%、20.04~83.12%、26.20~88.52%,48小时IC50约为3μmol/L;②3μmol/L ATRA作用于RPMI8226 48小时,FCM检测细胞周期显示:对照组和ATRA组G2/M期细胞比率分别为9.67±0.94%和18.91±1.77%(P0.05);FCM检测细胞凋亡显示:对照组和ATRA组凋亡率分别为18.66%和33.46%。(9)3μmol/L ATRA作用于RPMI8226 48小时后,real-time PCR显示:mi R-16表达上调,CDC25B m RNA表达下调;Western blot显示:CDC25B蛋白水平表达明显下调。结论:(1)在多发性骨髓瘤中高表达的CDC25B有可能成为骨髓瘤治疗的新基因靶标;(2)CDC25B沉默后RPMI8226骨髓瘤细胞株表现为细胞增殖受抑,促进凋亡,细胞周期阻滞于G2/M期;(3)mi R-16靶向抑制CDC25B后可抑制骨髓瘤细胞增殖,促进凋亡,细胞周期阻滞于G2/M期;(4)维甲酸可能通过上调mi R-16,从而抑制CDC25B表达而影响骨髓瘤细胞的生物学行为。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.71

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本文编号：1705330