基于DIP病毒的肿瘤相关γ疱疹病毒—宿主拮抗机制研究

发布时间：2018-04-03 17:07

本文选题：γ疱疹病毒　切入点：DIP　出处：《浙江大学》2016年博士论文

【摘要】：研究背景和研究目的人类γ疱疹病毒与一些恶性肿瘤的发生密切相关,如EBV与Burkitt's淋巴瘤、霍奇金病、鼻咽癌(NPC)等相关,HHV-8/KSHV与卡波西肉瘤(KS) (AIDS病人中最常见的肿瘤)、原发性渗出性淋巴瘤(PEL)和多灶性卡斯特莱曼病(MCD)等相关。Y疱疹病毒感染宿主后,经过急性裂解复制阶段,可以快速被宿主清除但能通过多种免疫逃逸策略在宿主中建立潜伏感染,并终身存在宿主体内。潜伏感染及免疫逃逸的存在使得被感染细胞容易转化,与恶性肿瘤形成密切相关。EBV和KSHV为种属特异性病毒,仅能感染人类和一些灵长类动物,且无法建立有效的细胞感染模型。鼠疱疹病毒68(murine herpesvirus 68, MHV-68)是从野生仓鼠中分离得到的一种γ疱疹病毒,与人类v疱疹病毒高度同源,并可感染小鼠等模式动物。因此,成为人类研究Y疱疹病毒与其宿主相互作用及探究各种γ疱疹病毒疫苗有效性的很有价值的模型。RTA (replication and transcription activator,复制和转录活化位点)是调节疱疹病毒从潜伏期进入裂解复制的一个关键即刻早期基因产物。RTA在Y疱疹病毒中是保守的。RTA的表达可活化裂解复制相关基因,打破病毒潜伏状态,促使病毒进入裂解复制。RTA的持续表达则可抑制病毒建立潜伏感染。已知,在MHV-68基因组中,ORF73的产物可抑制RTA的表达和功能,敲除ORF73的病毒其潜伏感染能力下降。ORF72、M11和ORF74位于ORF73附近,这些基因在病毒的潜伏期进行转录,与病毒的潜伏感染及致瘤性密切相关。与其他肿瘤相关疱疹病毒一样,MHV-68存在多种免疫逃逸机制来抑制宿主的天然免疫和适应性免疫。其ORF10、11、36、54可以抑制Ⅰ型干扰素产生或者发挥作用,其M3基因具有泛素连接酶功能,能降低MHC Ⅰ类分子在感染细胞表面的表达,去除这些基因可提高宿主对病毒的识别及杀伤。基于以上认识,我们在MHV-68背景基础上构建了DIP (deficient in immune evasion and persistence)重组病毒,该病毒去除了ORF10、11、36、54、M3等抑制宿主免疫反应的基因以及ORF72、73、74、M11等潜伏期相关基因并持续活化复制和转录激活蛋白(RTA)。小鼠接种试验表明DIP不会建立潜伏感染、并提供免疫保护作用。因此,将DIP作为一个“工具病毒”,研究该病毒的生物学特征及其刺激宿主所产生的免疫应答,将有组于我们理解机体抗病毒免疫调控机制,并加深我们对γ疱疹病毒潜伏感染和免疫逃逸的认识。本文的研究目的是通过对DIP病毒体内复制特性和诱导的宿主免疫反应的研究,寻找宿主调控病毒潜伏感染和免疫逃逸的可能机制。我们发现DIP MHV-68感染可以诱导产生大量的IFN-γ。因此我们进一步明确了IFN-γ对MHV-68裂解复制的作用和MHV-68抗IFN-γ的效应及Ⅰ型干扰素在IFN-γ抗MHV-68感染过程中所起的作用。研究方法和结果本文的第一部分我们对构建的DIP MHV-68在体内的复制特性及宿主的免疫应答进行了研究。通过建立体内感染模型：BALB/c小鼠经鼻感染DIP MHV-68或者野生病毒,分别于感染后3天、6天和14天,收集肺组织或脾组织,通过plaque assay或者infectious center assay检测病毒的裂解复制和潜伏感染情况,结果发现DIP无法在体内建立裂解复制和潜伏感染。RT-qPCR动态的检测病毒基因和细胞炎症因子、干扰素相关因子和一些细胞因子的表达,发现DIP病毒感染后,病毒基因转录水平迅速升高,感染后第3天达到高峰,而后开始下降,于第6天降至较低的水平。而IFN-γ的表达量在第6天明显高于野生病毒,炎症因子IL-1β和TNF-α感染后第1天即达高峰,而后逐渐下降,至第6天与野生病毒相似。ELISA结果显示DIP感染后第6天小鼠血清和肺泡灌洗液中IFN-γ分泌量明显增高。以上研究结果提示我们,IFN-γ在MHV-68感染免疫中发挥了重要的作用,后面的研究内容集中于IFN-γ与MHV-68的相互作用展开。本文的第二部分我们对IFN-γ在MHV-68裂解复制中的效应进行了研究。首先我们将野生MHV-68经鼻感染WT和IFN-γR-/-小鼠,plaque assay和DNA PCR分别检测病毒滴度和DNA拷贝数,结果显示WT和IFN-γR-小鼠之间没有明显的差别,病毒腹腔感染小鼠也出现同样的结果。通过RT-qPCR和ELISA检测野生病毒感染C57BL/6和BALB/c小鼠后IFN-γ的表达和分泌情况,发现均产生极低的IFN-γ。而腹腔注射IFN-γ可以抑制腹腔感染病毒的复制。IFN-γ预处理BMM、RAW 264.7、 MEF、NIH3T3和MLE-12细胞可显著抑制MHV-68在这些细胞的复制,表现为病毒滴度下降、DNA拷贝数下降、ORF50表达下降。提取IFN-γR-/-小鼠的BMM细胞和PM细胞检测IFN-γ的抗病毒作用,发现IFN-γ抑制MHV-68的复制作用依赖IFN-v受体的完整性。本文的第三部分对Ⅰ型干扰素与Ⅱ干扰素交互作用对IFN-γ抗病毒作用的影响及其机制进行了研究。通过RT-qPCR和ELISA,我们发现IFN-γ预处理的BMM细胞感染MHV-68后可以诱导Ⅰ型干扰素的表达和分泌。通过中和抗体抑制IFN-α明确分泌的IFN-α具有抑制MHV-68复制的活性。RT-qPCR结果显示IFN-γ可以诱导Ⅰ型干扰素下游ISGs的表达,包括MX1和IRF7。通过RT-qPCR检测 IFN-γ对Toll样受体的调节作用显示IFN-γ可以上调BMM细胞上TLR9的表达,且上调作用依赖于IFN-γ受体和STAT1。Western blotting发现BMM细胞感染MHV-68后,IFN-γ上调TLR9可使IRF7磷酸化增强。抑制剂或者小干扰RNA抑制TLR9后,Ⅰ型干扰素产生明显下降,伴随着IFN-γ的抗病毒作用减弱。通过Ch IP-qPCR实验,我们发现p-STAT1不能与TLR9的启动子区结合。本文的第四部分,我们研究了病毒拮抗IFN-γ的作用及相关的机制,发现MHV-68感染BMM细胞可以诱导SOCS1产生,抑制STAT1的磷酸化从而抑制IFN-γ的抗病毒作用。通过检测病毒的生长曲线,发现IFN-γ诱导的抗病毒作用在MHV-68感染的BMM细胞逐渐减弱,Western blotting检测发现随着感染时间延长,STAT1磷酸化水平被抑制。通过筛选JAK-STAT1负向调控因子发现MHV-68感染BMM细胞可以上调SOCS1的表达,且UV灭活的MHV-68无法诱导SOCSl产生。BMM细胞转染SOCS1特异性的siRNA可以逆转这一现象,表现为IFN-γ的抗病毒作用增强且诱导的STAT1磷酸化持续活化。通过转染TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR9特异性的siRNA检测SOCS1的表达,发现下调TLR3的表达,SOCS1产生明显下降；且TLR3信号通路激动剂poly(I:C)可以诱导SOCS1的表达；BMM细胞干扰或者敲除MyD88对SOCS1产生没有影响. Western blotting检测MHV-68感染后TLR3下游信号通路活化情况,发现MHV-68感染BMM细胞可以活化NF-κB、p38、ERK、JNK信号通路。用这些信号通路的特异性抑制剂处理细胞后显示只有抑制NF-κB后,SOCS1产生下降。最后,我们取不表达TLR3的NIH3T3细胞,IFN-γ处理可以持续抑制MHV-68的复制,表现为病毒滴度持续下降,并且STAT1磷酸化水平保持稳定。过表达SOCS1可使IFN-γ的抗病毒作用减弱,伴随着STAT1磷酸化水平的下降。结论1.DIP MHV-68病毒无法在BALB/c小鼠体内建立裂解复制和潜伏感染并可诱导机体产生大量的IFN-γ,说明IFN-v可能在此过程中发挥了重要的作用且野生病毒存在抑制IFN-γ产生的机制。2.IFN-γ可直接抑制MHV-68的复制且抑制效应具有广泛性：IFN-γ经与IFN-γ受体结合,抑制MHV-68在巨噬细胞、成纤维细胞和上皮细胞的复制。3.在BMM细胞,IFN-γ抑制MHV-68存在新的机制：IFN-γ通过上调Toll样受体9的表达,诱导Ⅰ型干扰素产生,Ⅰ型干扰素与Ⅱ型干扰素协同发挥抗病毒的作用。4.MHV-68利用宿主因素作为病毒拮抗IFN-γ的机制以利于病毒的存活：在BMM细胞,MHV-68感染活化TLR3-TRAF-NF-κ B信号通路产生宿主性细胞因子SOCS1抑制S TAT1磷酸化从而抑制IFN-γ的抗病毒效应。创新性1.以鼠γ疱疹病毒MHV-68为研究模型,率先构建了一个裂解复制、潜伏感染、免疫逃逸缺陷的重组病毒DIP。通过对该病毒的研究,有助于我们了解病毒潜伏感染、免疫逃逸机制及γ疱疹病毒如EBV、KSHV的致瘤机制。2.首次发现IFN-γ通过上调TLR9的表达,进而促进Ⅰ型干扰素的产生。我们的研究除了阐明IFN-γ抑制MHV-68裂解复制的机理外,还有助于了解Ⅰ型干扰素和Ⅱ型干扰素在肿瘤相关病毒感染过程中的相互关系。3.阐明MHV-68感染BMM细胞可以诱导宿主产生SOCS1来抑制IFN-γ的抗病毒作用。发现了MHV-68感染宿主后的又一免疫逃逸机制,为了解EBV、KSHV与宿主的相互作用提供了新的研究成果。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R373.11;R73

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