MicroRNA-340通过靶向JAK1抑制肝癌细胞增殖和侵袭的机制研究

发布时间：2018-04-04 20:34

本文选题：miR-340　切入点：肝癌　出处：《第二军医大学》2017年硕士论文

【摘要】：一、研究背景及目的肝细胞癌(HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一。目前的治疗措施主要有手术切除、化疗和肝移植等。但是由于HCC较高的肝外转移和术后复发率,5年生存时间依然较低。尽管科学家们在肝癌的研究领域付出了艰辛的努力也取得了很多的成果,但HCC发生发展的分子机制目前仍不明确。JAK激酶是非受体酪氨酸激酶家族中的一员,包括JAK1,JAK2,JAK3和TYK2。能够在各种细胞因子和生长因素作用下激活STAT(signal transducer and activator of transcription)蛋白。JAK1/STAT信号通路在正常的细胞中被严格监控。但在癌细胞中它会被JAK家族激酶或其他的酪氨酸激酶持续激活。在所有的JAK1/STAT家族中,JAK1/STAT3起着很重要的生物学作用,如细胞的增长、凋亡、迁移和入侵。在不同类型的肿瘤,比如HCC、头颈部肿瘤、乳腺癌、肺癌等中STAT3都会被异常激活。最近的研究表明,持续激活JAK1/STAT3与肿瘤发生和癌症进展相关。所以JAK1/STAT3信号通路有望成为治疗癌症的新途径。Micro RNA(miRNA)是一种大小约21~25个碱基的非编码小RNA。近来研究表明,miRNA通过抑制特定的癌基因或抑癌基因,在肿瘤发生发展中起着重要的作用。miRNA通过靶向癌基因或抑癌基因发挥类似肿瘤抑制因子的作用,参与肿瘤的转化、生长、血管生成及EMT等多种过程。越来越多的证据表明miRNA表达失调与肿瘤的发生发展密切相关。miR-340在多种肿瘤中表达下调。然而,miR-340抑制肝细胞癌的作用机理尚不清楚。我们探讨miR-340在肝癌侵袭转移中的调节作用及其分子机制,为寻找新的肝癌治疗靶点提供理论依据。二、材料与方法1.细胞培养人类HCC细胞系(SK-Hep-1,Hep G2,HCCLM3和MHCC97-H)、人类肝细胞系L02购自中科院(上海)。用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基在37℃,5%CO2孵箱中常规培养细胞。2.病人和组织标本从本院手术室获取32例手术切除的HCC肿瘤及癌旁组织标本。所有病人在手术前未进行过放疗或化疗等治疗。经过了所有病人或家属的知情同意并于术前签署了知情同意书。该研究经过了伦理委员会批准。3.质粒构建细胞转染miR-340 mimics,antagomir-340及其阴性对照购自广州市锐博生物科技有限公司。过表达miR-340的慢病毒和阴性对照购自上海吉玛制药技术有限公司。通过PCR扩增JAK1的野生型3'-UTR,其含有miR-340结合位点。在miR-340结合位点序列中产生突变。将PCR产物插入p GL3-对照荧光素酶载体(Promega)中。对于JAK1过表达,将JAK1的开放阅读框插入pc DNA3.1载体中。使用Lipofectamine2000 Reagent(Invitrogen)根据制造商的方案进行转染。4.RNA提取和q RT-PCR使用mir VANA RNA分离试剂盒根据制造商的方案从细胞系和冷冻的肿瘤样品提取总RNA。使用Prime Script RT试剂盒(Ta Ka Ra)进行互补DNA合成。在ABI 7900系统(Applied Biosystems,Carlsbad,CA)中用SYBR green Premix Ex Taq II(Ta Ka Ra)进行q RT-PCR。β-actin或U6用作内源对照。根据2-△△CT方法计算靶基因的相对表达水平。5.MTT和克隆形成实验通过MTT测定评估细胞活力。将细胞以4×103个细胞/孔的密度接种在96孔板中,并在转染后培养1,2,3和4天。将体积为100μl的MTT(0.5mg/ml,Invitrogen)加入96孔板的每个孔中,并将细胞在37℃下再温育4小时,随后除去上清液,并加入150μl的二甲基亚砜(Sigma,St.Louis,MO)。使用酶标仪(Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL)测量490nm处的吸光度。对于克隆形成测定,将转染的细胞以每孔1000个细胞的密度在6孔板中培养并生长12天。用甲醇固定后,用0.1%结晶紫染色菌落15分钟并洗涤。在光学显微镜下计数菌落数。6.侵袭实验使用涂有Matrigel胶(BD Biosciences,San Jose,CA)的24孔Transwell室检测细胞的侵袭能力。将总共1×104个转染的细胞在无血清培养基中接种在上室中。下室充满含有10%FBS的DMEM作为化学引诱物。孵育48小时后,将粘附在膜下侧的细胞固定,染色并使用显微镜计数。7.划痕实验将转染的细胞在24孔板中培养。用200μL移液管尖端刮擦细胞层,观察愈合过程。在划伤后一定时间测量划痕宽度,以评估细胞的迁移能力。8.Western blotting抽提总蛋白,通过SDS-PAGE分离,并电泳转移到PVDF膜(Millipore,Billerica,MA)上,然后进行免疫杂交、显影及定影。9.荧光素酶活性检测将荧光素酶报告基因载体瞬时转染48小时后,通过双荧光素酶报告测定系统(Promega)检测荧光素酶活性。10.裸鼠成瘤实验将感染慢病毒Lv-miR-340的HCCLM3细胞(2×106)皮下注射到5周龄BALB/C裸鼠中。每5天使用卡尺测量肿瘤体积:V(mm3)=0.5×长度×宽度的平方。30天后处死裸鼠并摘取肿瘤称重,拍照,固定并包埋。11.统计分析数据表示为平均值±SD。用T检验评估两组之间的显著性。Spearman相关性检验用于检查miR-340和JAK1表达之间的相关性。所有统计分析均使用SPSS13.0进行,统计学显著性设为P0.05。三、实验结果1.miR-340在HCC组织和细胞系表达下调在32例HCC组织样本和相对应的癌旁无瘤肝组织中通过q RT-PCR评估miR-340的表达水平。结果显示在HCC组织中miR-340的表达显著低于相对应的癌旁无瘤组织。之后,我们检测了miR-340在4种肝癌细胞系(Hep G2,SK-HEP-1,HCCLM3和MHCC97-H)和1种人类正常肝组织细胞系LO2。与肿瘤组织的表达一致,与LO2细胞系相比在4种HCC细胞系中miR-340表达抑制。这些结果表明miR-340的表达下调可能在HCC的发生和发展过程当中起着重要的作用。2.miR-340对HCC细胞增殖、迁移和入侵的影响研究miR-340在HCC的发生发展中的生物学功能。HCC细胞系HCCLM3、MHCC97-H分别转染miR-340 mimics及其对照miR-control。转染48h后,分别收获对数生长中期、生长状态良好的转染细胞系,应用细胞培养液制成单细胞悬液,每孔接种2×103个细胞。每组设8个平行孔。MTT实验结果表明相比于对照组过表达miR-340细胞活性降低。克隆形成实验显示与对照组相比两种细胞系的miR-340过表达组克隆形成能力显著降低。之后我们研究了miR-340对HCC细胞迁移和侵袭能力的影响,划痕实验的数据显示,相比于对照组过表达miR-340的HCCLM3和MHCC97-H细胞降低了划痕关闭能力。Transwell小室过表达miR-340的细胞穿膜细胞数量显著降低。另一方面,我们将Hep G2转染antagomir-340及其对照(终浓度为100n M)。正如预期的,结果表明抑制miR-340的表达显著增强了Hep G2细胞的增殖、迁移和侵袭能力。这些结果都表明miR-340可显著地抑制HCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力。3.miR-340过表达对裸鼠HCC移植瘤的影响前边的实验都说明了miR-340具有抑制HCC的作用。为了进一步了解其作用,我们设计了裸鼠成瘤实验模型。LM3感染慢病毒Lv-miR-340及其对照(购自汉恒生物),收集对数生长期的感染细胞及对照细胞,PBS洗两次后,制成100μl含1×106个细胞的单细胞悬液。用75%酒精消毒裸鼠肩胛骨部位,抽取上述细胞悬液进行注射,将裸鼠饲养于无菌饲养室中。待瘤体形成后,密切观察肿瘤生长情况,用游标卡尺测量肿瘤大小(长L、宽W),计算肿瘤体积V=0.5×L×W2,绘制肿瘤的生长曲线。30天后处死裸鼠并摘取肿瘤称重。与体外结果一致,miR-340过表达抑制体内肿瘤的生长,过表达组肿瘤的尺寸大小和重量都明显小于对照。我们将皮下种植瘤标本进行了q RT-PCR分析,结果确认了在miR-340过表达组中miR-340是高表达的。将皮下种植瘤标本进行免疫组化,miR-340过表达组中细胞增殖标记物Ki67相比于对照组中明显减少,说明HCC细胞增殖活动减弱。这些数据表明miR-340在体内同样抑制HCC细胞的生长。4.miR-340作用靶标JAK1以上的实验表明miR-340可在体内体外显著地抑制HCC细胞的增殖、迁移和侵袭。我们使用在线公开的数据库(Target Scan和miRanda)来预测miR-340的靶基因。JAK1在恶性肿瘤细胞的生长和转移中起着重要的作用,被认为是一个潜在的靶标。我们用荧光素酶实验来评估JAK1是否是miR-340的直接靶标。miR-340过表达会降低JAK1的信使RNA 3'-UTR荧光素酶的活性,而JAK1信使RNA 3'-UTR突变型荧光素酶没有影响。结果显示在HCCLM3和MHCC97-H细胞中转染miR-340 mimics抑制JAK1的表达。我们用Western blot实验分析JAK1蛋白在几种HCC细胞系中的表达,与对照组相比miR-340组JAK1低表达。这些结果表明miR-340通过直接作用于JAK1的3'-UTR调控JAK1表达。5.JAK1表达的改变影响miR-340对HCC细胞的作用miR-340可以直接作用于JAK1,使得我们想进一步探索其中机制。我们通过功能分析来验证这种假设。LM3细胞转染miR-control、miR-340 mimics、miR-340mimics+pc DNA3.1/JAK1。通过Western blot分析JAK1蛋白的表达情况。结果显示缺失3'-UTR的JAK1信使RNA部分消除了miR-340对HCC细胞的抑制作用。6.miR-340调节JAK1/STAT3信号通路。JAK1/STAT3信号通路是一个与肿瘤生长于转移相关的生物信号通路。通过研究JAK1/STAT3主要靶基因的表达探索miR-340是否是通过调节JAK1/STAT3信号通路来调控HCC细胞的发生发展。在转染miR-340 mimics的HCCLM3、MHCC97-H细胞中p-STAT3,Bcl-2,cyclin D1和MMP2表达水平明显减少。相反的,在同时转染了miR-340 mimics和JAK1质粒的细胞中这些分子的表达显著增加。这些结果表明JAK1/STAT3信号通路有效的参与了miR-340对HCC细胞生长和侵袭的作用过程。四、结论我们的研究表明miR-340通过调节JAK1/STAT3途径抑制HCC的增殖、迁移和入侵,表明其有望成为治疗HCC的新靶标。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.7

【参考文献】