Src在Y74、Y272磷酸化TOPK对结肠癌发生的作用及机制研究

发布时间：2018-04-05 09:37

本文选题：TOPK　切入点：Src　出处：《华中科技大学》2016年博士论文

【摘要】：目的：TOPK作为一种丝／苏氨酸蛋白激酶,在多种肿瘤中呈高表达,并能促进结肠癌的发生,但其激活机制尚不清楚。Src的活性在80%的结肠癌中有增强,且TOPK存在Src磷酸化保守序列。本研究将探索Src是否为TOPK的直接上游激酶,并确认其磷酸化位点,制备磷酸化抗体探讨TOPK被Src磷酸化后在结肠癌发生中的作用及其机制。方法：1.通过体外激酶实验验证Src是否可磷酸化TOPK,利用NetPhos2.0软件及肽谱磷酸化方法筛选出其可被磷酸化的位点。2.制备相应的磷酸化抗体(p-TOPK(Y74)、p-TOPK(Y272)),构建TOPKY74、Y272单突变和Y74Y272双突变原核表达质粒,并表达蛋白,通过体外激酶实验验证Src在Y74、Y272磷酸化TOPK。3.利用激光扫描共聚焦显微镜观测Src是否与TOPK共定位,并通过pull-down技术检测细胞内Src是否与TOPK共结合。4.瞬时转染pcDNA3-HA-TOPK和pcDNA4-His-Src到HEK293T细胞,EGF刺激后,通过western blot法检测细胞内p-TOPK (Y74)的表达情况。5.在结肠癌细胞内分别给予EGF时间依赖性刺激,用Src抑制剂达沙替尼作用以及建立src基因沉默稳定细胞系,用磷酸化抗体验证细胞内Src可在Y74磷酸化TOPK。6.构建TOPKY74、Y272单突变和Y74Y272双突变真核表达质粒,在JB6和SW480细胞建立TOPK单突变和双突变稳定细胞系,通过生长曲线检测细胞的增殖变化,利用软琼脂克隆形成实验检测位点突变后细胞的锚定非依赖性生长能力(即克隆形成能力)的改变。7.在TOPK野生型和双突变型JB6稳定细胞系(JB6/WT和JB6/FF),敲除Src后的MEF细胞系(Src+/+和Src-/-)及达沙替尼作用后的结肠癌细胞系SW480、HCT15及HCT116中用western blot法检测TOPK的底物p-Histone H3 (S10)的表达,观察TOPK的活性变化情况。8.将建立的TOPK野生型和双突变型SW480稳定细胞系细胞(SW480/WT/和SW480/FF)注射入裸鼠体内,通过裸鼠荷瘤实验检测FF/SW480细胞成瘤能力的变化情况。9.在HEK293T细胞中过表达Src、TOPK及泛素分子Ubiquitin,通过免疫沉淀实验检测TOPK泛素化结合能力的变化情况。10.用放线菌酮(CHX)分别作用于瞬时转染野生型TOPK (TOPK-WT)和双突变型TOPK(TOPK-FF)的HEK293T细胞以及Src+/+和Src-/- MEFs, western blot法检测TOPK的半衰期。结果：1.体外激酶实验结果显示活性Src可磷酸化无活性TOPK。NetPhos2.0软件打分预测和肽谱磷酸化筛选出Y74和Y272为Src磷酸化TOPK的酪氨酸位点。2.体外激酶实验验证制备的p-TOPK (Y74)抗体识别TOPK第Y74位点的磷酸化。3.激光共聚焦结果显示Src在细胞内与TOPK共定位,pull-down结果表明Ni-NTA-His-TOPK可结合细胞内Src。4.共转染pcDNA3-HA-TOPK和pcDNA4-His-Src到HEK293T细胞后,p-TOPK (Y74)抗体能识别磷酸化的TOPK,并且EGF刺激增强了p-TOPK(Y74)的表达。5.分别用EGF刺激结肠癌细胞SW480 0,5,15,30分钟后,内源性p-TOPK(Y74)的表达水平增强；用Src抑制剂达沙替尼作用于结肠癌细胞24h或者沉默结肠癌细胞内Src后,内源性p-TOPK (Y74)的表达水平降低。6.在过表达TOPK野生型(WT)、单突变(74F；272F)和双突变(FF)的JB6和SW480细胞系中,各突变组细胞生长较野生型组慢(P0.05,差异具有统计学意义),并且突变组细胞的锚定非依赖性生长能力较野生型组降低,即突变后细胞的肿瘤发生能力下降。7.与JB6/WT组相比较,JB6/FF组细胞p-Histone H3 (S10)的表达明显降低；而在Src-/- AMEFs和达沙替尼作用后的结肠癌细胞系SW480、HCT15以及HCT116中,p-Histone H3 (S10)的表达也降低,Src磷酸化TOPK增强了TOPK的活性。8.裸鼠荷瘤实验显示SW480/FF组肿瘤增长速度明显减慢(P0.05,差异具有统计学意义),最终形成的肿瘤体积也明显较SW480/WT组小,并且SW480/FF组肿瘤中p-Histone H3(S 10)的表达水平明显低于SW480/WT组。9.共转染Src后,TOPK的泛素化结合水平明显降低,说明Src抑制了TOPK的泛素化诱导的降解途径。10. TOPK-FF组细胞中TOPK的半衰期较TOPK-WT短；Src"-/- MEFs中TOPK的稳定性也较Src+/+ MEFs差,说明Src增强TOPK的稳定性。结论：Src在Y74、Y272磷酸化TOPK,增强其活性和稳定性,从而促进了结肠癌的发生。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect and mechanism of TOPK on the phosphorylation of TOPK in colon cancer cells . In addition , EGF stimulated the expression of p - TOPK ( Y74 ) . 5 . The expression level of endogenous p - TOPK ( Y74 ) was enhanced after 5 , 15 and 30 minutes respectively with EGF - stimulated colon cancer cells SW480 0 , 5 , 15 and 30 minutes .
The expression level of endogenous p - TOPK ( Y74 ) was decreased after 24 h or silent colon cancer cells in colon cancer cells . 6 . After overexpression of TOPK wild - type ( WT ) and single mutation ( 74F ) , the level of endogenous p - TOPK ( Y74 ) decreased .
In the JB6 and SW480 cell lines of 272F ) and double mutation ( FF ) , the cell growth of each mutant group was slower than that in the wild type group ( P0.05 , the difference was statistically significant ) , and the anchoring non - dependent growth capacity of the mutant group cells was lower than that in the wild type group , that is , the capacity of the tumor of the mutant cells decreased . 7 . Compared with the JB6 / WT group , the expression of p - Histone H3 ( S10 ) in the JB6 / FF group was obviously reduced ;
The expression of p - Histone H3 ( S10 ) in SW480 / FF group decreased significantly ( P0.05 ) . The half - life of TOPK in TOPK - FF group was shorter than that of TOPK - WT ;
The stability of TOPK was also lower than that of src + / + MEFs , which indicated that the stability of TOPK was enhanced . Conclusion : In Y74 and Y272 , the activity and stability of TOPK were enhanced , and the occurrence of colon cancer was promoted .

【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.35

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